[發明專利]一種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽IL－18基因共表達DNA疫苗pIRES－N/IL18

無效

• 申請號: 200810044944.3
• 申請日: 2008-03-11
• 公開（公告）號: CN101235386A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 王紅寧;陽泰;張毅;李玉玲;唐夢君;夏青青;曾瑜虹
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/62;A61K48/00;A61P31/14;A61P11/00
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[技術領域]本發明涉及動物醫藥生物工程領域，是一種禽傳染性支氣管炎病毒N基因與禽IL-18基因共表達DNA疫苗pIRES-N/IL18。

[背景技術]禽傳染性支氣管炎(Avian?Infectious?Bronchitis，IB)是冠狀病毒科冠狀病毒屬的禽傳染性支氣管炎病毒引起的雞的一種急性、高度接觸性的傳染病，其特征為病雞出現呼吸道癥狀、產蛋數量和品質下降以及腎臟病變等。禽傳染性支氣管炎病毒可感染所有日齡的雞，導致生長遲緩、死亡、增重和飼料報酬降低；還常常引起霉形體混合感染以及大腸桿菌病等繼發感染而提高雞群的死亡率，給養雞生產帶來巨大損失。目前，該病呈世界廣泛流行，是嚴重危害世界養禽業的重大傳染病之一。

禽傳染性支氣管炎病毒是冠狀病毒科冠狀病毒屬的代表種，其抗原性異常復雜，目前世界上分離的臨床毒株已超過100多株，分屬30種以上血清型。禽傳染性支氣管炎病毒屬于單股正鏈的RNA病毒，基因組全長27.6kb，主要編碼三種結構蛋白：纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核蛋白(N)。許多研究表明，S蛋白裂解為S1和S2兩個亞單位，其中S1蛋白可誘導產生中和抗體和血凝抑制抗體，為IBV的主要免疫原。N蛋白攜帶著T細胞表位，在免疫和保護上可能發揮作用。M蛋白的免疫原性較低，也有報道M蛋白上可能存在著具有重要免疫作用的抗原決定簇，能誘導細胞介導的免疫反應(參見：殷震，劉景華等.動物病毒學(第二版).北京：科學出版社，1997)。

禽傳染性支氣管炎病毒不同毒株在毒力、致病性和組織嗜性上存在著很大差異，不同血清型毒株之間交叉保護力弱。在防制上，常規單一毒株疫苗常有免疫失敗的報道，多價疫苗可較好解決防治問題。滅活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返強的問題，且能激發良好的體液免疫反應。其不足之處是使用劑量大，需要配合佐劑，制備比較復雜，因而成本較高。加之滅活疫苗不能誘發機體產生細胞免疫，而一系列的研究證實在IBV的免疫保護中，體液免疫和細胞免疫占有重要地位(參見：王紅寧主編.禽呼吸系統疾病.北京：農業科技出版社，2002；BW卡爾尼克主編.禽病學(第九版).北京：北京農業大學出版社，1991，407-418；Kusters?J?G，Niesters，H?G?M，et?al.Virology，1989，169：217-221；AvellanedaG?E，Villeges?P，Jackwood?M?W，et?al.Avian?Dis，1994，38：589-597)。

近年來許多研究者試圖研究禽傳染性支氣管炎病毒的DNA疫苗，并取得了一定的進展。步志高等(參見：步志高，江國托等.中國獸醫學報，1998，18(6)：527-530)以國內類M41地方流行株IBV纖突糖蛋白S1基因為免疫原基因，構建了DNA免疫表達質粒，并對其免疫原性進行了初步分析。結果表明該表達質粒可同時誘導機體形成針對IBV的細胞免疫和體液免疫反應。陳洪巖等(參見：陳洪巖，江國托，楊奇偉等.中國預防獸醫學報，1999，21(4)：250-253)將雞傳染性支氣管炎病毒腎型T株S1基因cDNA連接于pcDNA3構建了真核表達質粒，經肌肉注射免疫SPF雞后血清IgG抗體逐漸升高，至35日齡左右達到高峰，但血清IgG抗體升高幅度不及IB油苗。免疫攻毒后有40％的雞可耐過強毒的攻擊。劉思國等(參見：劉思國，康麗鵑，江國托等.中國獸醫學報，2001，21(1)：14-16)將雞傳染性支氣管炎HB株的N基因亞克隆到pcDNA3，構建了真核表達質粒pcDNA-N。用該質粒兩次免疫SPF雛雞一周后進行攻毒試驗，結果保護率為40％，表明N蛋白介導的細胞免疫在抗感染中發揮了作用。Kapczymki?DR等(Kapczynski?D?R，Hilt?D?A，Shapiro?D，et?al.Avian?Dis，2003，47：272-285)將構建的表達S1蛋白的DNA疫苗通過胚內接種或肌注，結果顯示，18日齡的雞胚先用此疫苗免疫，在雛雞孵出2周后再用弱毒苗加強免疫，可使雞得到100％保護，而單用DNA疫苗胚內接種或弱毒苗肌注雛雞，保護率都小于80％。劉兆球等(劉兆球，姜世金，常維山等.中國獸醫學報，2005，25(3)：241-243)用IBV?S1基因構建了真核表達載體pcDNA-S1，研究表明構建的DNA疫苗能誘導雞體產生特異性的免疫應答，抵抗強毒感染。DNA疫苗預防傳染性支氣管炎的研究發現，單一抗原的DNA疫苗存在免疫原性差、誘導機體產生的免疫保護率低等缺點。因此，如何提高機體免疫應答效率，增強DNA疫苗的免疫效果成為當前疫苗研究的關鍵問題。