[發明專利]CehA突變體蛋白、基因、重組載體及其用途和制備方法

有效

• 申請號: 200810043792.5
• 申請日: 2008-09-22
• 公開（公告）號: CN101684459A
• 公開（公告）日: 2010-03-31
• 發明（設計）人: 楊柏成
• 申請（專利權）人: 上海普天欣生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A62D3/02;A62D101/04
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司
• 代理人: 王 裕

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及CehA突變體蛋白、基因、重組載體及其用途 和制備方法。

背景技術

農藥殘留已成為突出的環境問題，越來越受到人們的關注，消除環境中殘留農藥 的研究也越來越受到重視。殘留農藥的去除方法主要有生物降解、物理降解、化學降 解等，其中生物降解是指通過生物(包括各種微生物、植物和動物)的作用將大分子分 解成小分子化合物的過程。生物降解因不帶入二次污染、條件溫和，而越來越受到重 視，已成為當前食品安全領域的研究熱點。化學農藥的生物降解主要是通過微生物、 降解酶、工程菌、植物來進行，其中降解酶往往比產生這類酶的微生物菌體更能忍受 異常環境條件，而且酶的降解效果遠勝于微生物本身，尤其是在殘留農藥質量濃度低 的情況下。

氨基甲酸酯類農藥的結構基于毒扁豆堿，骨架為氨基甲酸，屬于酯類有機化合物， 酯鍵斷裂后即失去毒性作用，常用的是N-甲酰氨基甲酸酯。它們是目前使用僅次于有 機磷農藥的一類殺蟲劑，常用的品種有呋喃丹、西維因、速滅威等。氨基甲酸酯類殺 蟲劑的毒理機制是抑制乙酰膽堿酯酶活性，阻斷正常神經傳導，多數屬中等神經毒， 這與有機磷類類似。但同有機磷類的機制又有所不同：1.它不需經代謝活化，可直接 與乙酰膽堿酯酶形成疏松復合體，抑制后者的活性。2.與乙酰膽堿酯酶可逆結合，形 成的復合物可迅速分解，故癥狀較輕，恢復較快。

現在隨著氨基甲酸酯類的廣泛使用，其殘留問題也凸顯了出來。但到目前為止，發 現的能水解氨基甲酸酯類農藥的酶，要么分子量過大，不利于工業化的應用，要么活 性不夠強。因此，尋找一種酶蛋白和方法，能有效地水解氨基甲酸酯類農藥，顯得愈 發重要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是尋找一種能高效降解氨基甲酸酯類殺蟲劑的酶蛋 白。

為解決上述問題，

一方面，本發明公開了一種CehA突變體蛋白，為如下(a)或(b)的蛋白：

(a)其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所述的蛋白；

(b)至少與(a)中的氨基酸序列70％同源性且具有水解的氨基甲酸酯類殺蟲劑或 毒素活性的蛋白，除了氨基酸序列如SEQ?ID?NO.7所述的蛋白。

其中所述CehA突變體蛋白與SEQ?ID?NO.1所述氨基酸序列具有至少75％的同源 性。更優選地，該CehA突變體蛋白與SEQ?ID?NO.1所述的氨基酸序列具有至少85％ 的同源性。

在實施方案里，本發明(b)中所述CehA突變體蛋白優選自氨基酸序列如SEQID N0.2～6所述的蛋白，其中最優選氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所述的蛋白。

本發明的發明思路為通過基因工程技術人為縮短CehA蛋白序列，從中獲得較原始 CehA蛋白具有更高水解氨基甲酸酯類殺蟲劑或毒素活性的突變體蛋白。在這一思路 下，本發明所保護范圍包括但不局限于上述突變體蛋白。

一方面，本發明公開了一種多核苷酸分子，其特征在于該多核苷酸分子編碼本發明 所述CehA突變體蛋白。

一方面，本發明公開了一種包含本發明所述多核苷酸分子的重組表達載體。

一方面，本發明公開了一種包含本發明所述重組表達載體的轉化體。

在一實施方式中，所述轉化體為大腸桿菌。

另一方面，本發明公開了一種本發明所述CehA突變體蛋白的制備方法，包括如下 步驟：

①CehA突變體蛋白表達載體的構建；

②CehA突變體蛋白轉化體的制備；

③CehA突變體蛋白的表達；

④CehA突變體蛋白的純化。

另一方面，本發明公開了一種降解氨基甲酸酯類殺蟲劑或毒素的組合物，包括本 發明所述CehA突變體蛋白和一種或多種可接受的載體。

另一方面，本發明公開了本發明所述CehA突變體蛋白在去除或降低氨基甲酸酯類 殺蟲劑或毒素的殘留或污染方面的用途。

與現有的CehA蛋白比較，本發明所述的CehA突變體蛋白活性更高，能有效地水 解氨基甲酸酯類農藥，并且分子量更小，更穩定，可開發為工業應用低成本和高質量 的酶制劑。這為解決氨基甲酸酯農藥殘留或污染提供了新的選擇。

附圖說明

圖1.純化后不同CehA突變體蛋自的電泳圖。