[發明專利]一次性測定生物體中十種氨基類生物活性物質的方法

無效

• 申請號: 200810043369.5
• 申請日: 2008-05-16
• 公開（公告）號: CN101581703A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 俞仲毅;季曉慧;金勇;施鑫偉
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N33/74;G01N33/68;G01N30/34
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁紀鐵

技術領域

本發明屬生物化學檢測領域，特別是涉及神經內分泌免疫網絡生物活性 分子的測定，尤其是生物體中(如血液或腦組織)氨基類生物活性物質的測 定方法。

背景技術

中醫藥的整體調節作用與神經內分泌免疫網絡密切相關，而腎上腺素 (E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、 谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三 碘甲狀腺原氨酸(T₃)等十種氨基類生物活性物質是對于研究神經內分泌免疫 網絡具有重要意義的因子。

腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、 組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸 (Gly)和三碘甲狀腺原氨酸(T₃)等十種氨基類生物活性物質的分子式中均 有氨基，丹酰氯能與氨基類化合物反應形成具有熒光的衍生物，可用于微量 活性物質的測定。以丹酰氯為衍生試劑測定血液中某一個氨基或者某幾個氨 基酸的文獻國內外均有報道，但將血液中氨基酸類和單胺類遞質一起，以丹 酰氯為衍生試劑檢測的色譜條件國內外未見報道；將氨基酸類和單胺類遞質、 組胺、三碘甲狀腺原氨酸一起，以丹酰氯為衍生試劑檢測的色譜條件國內外 未見報道。

將神經內分泌免疫網絡中的腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺 (DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、 γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲狀腺原氨酸(T₃)等十種氨基 類生物活性物質按照的常規檢測方法測定：如高效液相色譜—電化學檢測腎 上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)等兒茶酚胺類神經遞質；用 鄰苯二甲醛為熒光衍生試劑高效液相色譜熒光檢測法測定氨基酸類神經遞 質；用放免法測定三碘甲狀腺原氨酸等，一方面由于方法各異，因此，需要 被檢測的樣本量會比較大，增加實驗成本；另一方面，由于不同的檢測方法， 樣品前處理步驟不同，檢測的原理不同，會導致統一分析檢測指標的變化時， 實驗的系統誤差增加。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種一次性測定生物體中十種氨基類 生物活性物質的方法。本發明采用丹酰氯為衍生試劑一次性測定腎上腺素 (E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、 谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三 碘甲狀腺原氨酸(T₃)等十種氨基類生物活性物質，使生物體中腎上腺素等氨 基類生物活性物質的測定更加方便快速。

為了解決上述技術問題，本發明提供的一次性測定生物體中十種氨基類 生物活性物質的方法，包括如下步驟：

將生物體液經去蛋白處理后，加入KHCO₃溶液調PH值后，再加入和調PH 后溶液體積相同的、濃度為2-10mg/ml的丹酰氯進行衍生化反應，反應溫度 為80℃水浴，反應時間為20分鐘；

利用高效液相色譜儀和熒光檢測器完成對腎上腺素(E)、去甲腎上腺素 (NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、谷氨酸(Glu)、天冬 氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)和三碘甲狀腺原氨酸(T₃) 十種氨基類生物活性物質的檢測，其中，

色譜條件為：

色譜柱：Hypersil?ODS(C18)色譜柱，型號250×4.6mm，5μm；

流動相：流動相B是甲醇∶乙腈＝2∶3；流動相A是20mmol/l的醋酸鹽緩 沖液，其中加入3mmol/l的辛烷磺酸鈉，0.1mmol/l的Na-EDTA，并用氫氧化 鈉調至pH值4.8，用0.45um微孔濾膜過濾；

流速：1ml·min^-1；

柱溫：30℃；

熒光檢測器的激發波長為350nm，發射波長為510nm。

本發明中，液相色譜中采用梯度洗脫，梯度洗脫的條件如下表所列。