[發明專利]檢測Ⅲ型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 200810043344.5
• 申請日: 2008-05-08
• 公開（公告）號: CN101576560A
• 公開（公告）日: 2009-11-11
• 發明（設計）人: 車小燕;潘玉先;晉晶
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/577
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司
• 代理人: 陳 平

技術領域

本發明涉及一種檢測登革病毒NS1抗原的酶聯免疫試劑盒，以及這種試劑盒對登革熱作出早期分型診斷中的應用。

背景技術

登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，通過埃及伊蚊和白蚊伊蚊傳播，登革病毒有4個血清型：I型、II型、III型和IV型(簡稱DV1、DV2、DV3和DV4)，任何型別的登革病毒感染均可引起一系列的臨床癥狀，表現為隱性感染、發熱、登革熱、或更為嚴重的登革出血熱和登革休克綜合征。登革病毒主要流行于熱帶和亞熱帶地區，近100多個國家、25億人口受到威脅，在登革疫區中，多見4型登革病毒交替流行，更增加了不同型別反復感染的危險性。登革熱已成為一種嚴重危害人類健康的蚊媒病毒傳染病。初次感染登革病毒所獲得的免疫力對于同型病毒的再次感染可產生終身的免疫保護作用，但是對于其它型別登革病毒的再次感染僅能產生部分而且短暫的免疫保護作用。由于存在抗體依賴的感染增強作用，異型登革病毒再次感染是發生登革出血熱/登革休克綜合征的主要危險因素。

目前，具有保護性的登革病毒疫苗尚未研制成功，臨床上對于登革病毒的感染亦未有特異性的治療措施。但研究表明及早的臨床處理可以減少DHF的發病率和致死率。由于多數登革病毒感染者早期缺乏特異的臨床表現，登革病毒感染確診依賴于實驗室診斷手段。目前，登革病毒的實驗室診斷方法主要包括病毒分離、血清學檢測和核酸檢測。由于4種登革病毒的血清型之間，以及與其它黃病毒成員間存在共同抗原表位，用傳統的血清學方法如血凝抑制試驗、IgM和IgG抗體捕獲ELISA法等檢測時存在交叉反應，結果易出現假陽性，并且，血清學檢測方法也不能用于早期診斷。病毒分離是登革病毒感染診斷的金標準，并可進一步用于病毒血清型的鑒定，但是該方法費時而且對于實驗室的條件要求較高。RT-PCR敏感性高，并且可以鑒定病毒血清型，但因技術要求高、樣品易受污染且價格昂貴而使其應用受到限制。

登革病毒中的非結構蛋白1(nonstructural?protein?1，NS1)是一種重要的高度保守的糖蛋白，其抗原性很強，且研究發現在登革熱患者的早期血中存在高濃度的NS1循環抗原，因此檢測急性期病人血清中的循環NS1抗原可用于早期診斷登革病毒感染。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種具有高靈敏度和特異性的III型登革病毒NS1抗原的簡便快捷的免疫診斷試劑盒，直接從血液標本中檢測出DV3?NS1抗原，對登革熱作出早期分型診斷。

為了解決以上技術問題，本發明提供的檢測III型登革病毒的酶聯免疫試劑盒，包括包被有特異性抗體1D14A2A10的微孔反應板和標記有生物素的檢測抗體5D32A17。

其中，所述的單抗1D14A2A10和單抗5D32A17均屬IgG1類免疫球蛋白，能與III型登革病毒的非結構蛋白1(nonstructural?protein?1，NS1)結合，其中單抗1D14A2A10由保藏號為CCTCC-C200819的雜交瘤細胞株1D14A2A10分泌，單抗5D32A17由由保藏號為CCTCC-C200820的雜交瘤細胞株5D32A17分泌。雜交瘤細胞株1D14A2A10和5D32A17是用重組的NS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉免疫小鼠，然后用免疫后的小鼠脾細胞和商品化的小鼠骨髓瘤細胞融合，最后用HAT篩選得到。標記物可以是生物素、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、膠體金、熒光素等，優選生物素。當本發明檢測抗體上結合的標記物為生物素時，本發明試劑盒還含有標記有辣根過氧化物酶的親和素。親和素能與生物素以1∶4的比例結合，起到放大檢測信號的作用，進一步提高敏感度。為了實際應用中更方便操作，所述試劑盒還包括濃縮洗液、陽性對照、陰性對照、顯色液和終止液。

本發明的檢測III型登革病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒可達成以下功效：準確、快速地檢測出III型登革病毒，而與其它I型、II型和IV型登革病毒以及乙型腦炎病毒、黃熱病毒無交叉反應，有利于對登革病毒感染作出早期分型診斷；此外，該試劑盒成本低，對樣品處理過程要求簡單，能同時快速檢測大批樣品；主要試劑均以工作液形式提供，檢測方法簡便易行；具有高靈敏度、高特異性的特點。

附圖說明

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細說明。

圖1是單抗1D14A2A10與DV1感染C6/36細胞抗原片反應結果。

圖2是單抗1D14A2A10與DV2感染C6/36細胞抗原片反應結果。