[發明專利]用于骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方及使用方法

無效

• 申請號: 200810043324.8
• 申請日: 2008-05-06
• 公開（公告）號: CN101275120A
• 公開（公告）日: 2008-10-01
• 發明（設計）人: 黃遠亮;王磊;潘可風
• 申請（專利權）人: 上海市東方醫院
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 上海浦東良風專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳志良

技術領域

本發明涉及一種細胞培養液的濃度及使用方法，特別是公開一種用于骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方及使用方法。

背景技術

臨床上由于各種原因造成的種植體周圍骨缺損、骨量不足，影響種植修復效果，隨著組織工程技術的發展成熟，組織工程化骨為我們提供了一條新的思路。利用骨組織工程技術，將生長因子作為重要激活物與種子細胞、支架材料，立體培養等聯系在一起，成為構建骨組織再生修復必不可少的要素。

細胞生長調節因子(簡稱生長因子)是一類具有控制細胞生長和活性、具有促進或抑制細胞增殖、分化、遷移和基因的表達等生物效應的多肽類物質。其對細胞增殖、組織或器官的修復、再生具有重要的促進作用，甚至微克或皮克級的生長因子也能發揮明顯的作用。

已有多項實驗證實，成纖維細胞生長因子可促進骨髓基質細胞增殖。目前大部分學者認為，成纖維細胞生長因子是作用于骨髓基質細胞分化增殖的早期，應與其他多種因素聯合或序貫使用，才能達到促進骨髓基質細胞分裂增殖，增加細胞數量，同時促進細胞向成骨細胞分化的目的。在生長因子中，成纖維細胞生長因子對骨髓基質細胞具有最強的促增殖作用。不僅能提高骨髓基質細胞的增殖速度和壽命，且能在增殖過程中保持其多分化潛能。

骨細胞的微環境存在著多種生長因子，骨組織代謝是通過細胞因子網絡發揮調節作用，不同的因子作用于成骨的不同階段，且相互可能有協同作用。在不同的濃度，生長因子可以表現出相反的作用，選擇合適的濃度或比例成為探討熱點。重組人骨形成蛋白-2和成纖維細胞生長因子兩種因子成為骨修復重建領域的研究方向之一，但骨形成蛋白-2/成纖維細胞生長因子最佳濃度和比例尚無定論。

發明內容

本發明的目的在于提供一種通過重組人骨形成蛋白-2和堿性成纖維細胞生長因子的最佳濃度有效促進骨髓基質細胞成骨的促進骨髓基質細胞成骨溶液的配方及使用方法。

本發明是這樣實現的：一種用于骨髓基質細胞培養的誘導溶液的配方，包括在成骨條件基礎培養液中加入的生長因子溶液，所述生長因子溶液包括：重組人骨形成蛋白-2溶液50～200ng/ml，堿性成纖維細胞生長因子溶液25～50ng/ml，所述重組人骨形成蛋白-2溶液與堿性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比為1∶1～8∶1。

所述重組人骨形成蛋白-2與堿性成纖維細胞生長因子的最佳濃度比例優選1∶1～2∶1。

所述重組人骨形成蛋白-2溶液中含有濃度為0.1～1.0mg/ml的牛血清白蛋白溶液。

所述堿性成纖維細胞生長因子溶液中含有濃度為0.1～1.0mg/ml的三羥甲基氨基甲烷溶液。

所述成骨條件基礎培養液包含DMEM基礎培養液9～10mg/ml、抗生素20～40U/ml、體積比為溶液總量的10～20％的胎牛血清，所述成骨條件基礎培養液的ph值為7.2～7.4。

所述抗生素為青霉素或鏈霉素。

一種如上所述用于骨髓基質細胞培養的誘導溶液的使用方法，包括如下步驟：

(1)將1～2ml骨髓基質細胞放入濃度為9～10mg/ml、體積為10～15ml的成骨條件基礎培養液中培養并傳代；

(2)將上述傳代的骨髓基質細胞以1×10⁵～2×10⁵個/ml密度接種于培養板，加入濃度為9～10mg/ml、體積為10～15ml的成骨條件基礎培養液培養24～48小時；

(3)加入重組人骨形成蛋白-2溶液50～100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子溶液25～50ng/ml，置于37℃、5％CO₂、100％濕度環境中培養1～6天；所述加入的重組人骨形成蛋白-2溶液與堿性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比為：1∶1～8∶1；

(4)吸去培養液，用四甲基偶氮唑鹽比色法測定細胞增殖水平。

上述步驟(3)中加入的重組人骨形成蛋白-2溶液與堿性成纖維細胞生長因子溶液的最佳濃度比優選：1∶1～2∶1。

所述重組人骨形成蛋白-2溶液的配置方法為：將牛血清白蛋白溶于去離子水，配制成濃度為0.1～1.0mg/ml的牛血清蛋白溶液，將裝有重組人骨形成蛋白-2凍干粉的小瓶離心后，加入配好的牛血清白蛋白溶液，余量為水，最終溶液濃度為50～100ng/ml。

所述堿性成纖維細胞生長因子溶液的配置方法為：將三羥甲基氨基甲烷溶于去離子水，配制成PH8.5、濃度為0.1～1.0mg/ml的三羥甲基氨基甲烷溶液，將裝有堿性成纖維細胞生長因子凍干粉的小瓶離心后，加入配好的三羥甲基氨基甲烷溶液，余量為水，最終溶液濃度為25～50ng/ml。