[發明專利]一種甜瓜雜交種的鑒定方法

有效

• 申請號: 200810042936.5
• 申請日: 2008-09-12
• 公開（公告）號: CN101671724A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 李菊芬;馬國斌
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海世貿專利代理有限責任公司
• 代理人: 李浩東

技術領域

本發明涉及植物品種的鑒定方法，具體涉及利用分子標記(SCAR-SequenceCharacterized?Amplified?Regions)技術鑒定甜瓜(Cucumis?melo?L.)雜交種的純度及真實性的方法。

背景技術

甜瓜(Cucumis?melo?L.)是我國重要的經濟作物之一。隨著甜瓜產業的迅速發展，目前甜瓜雜交一代品種已廣泛應用于生產，但是在人工雜交制種過程中，由于隔離不嚴或人工去雄不及時、不徹底等原因，常混有母本自交系種子或由其它不明來源甜瓜花粉所造成種子的生物性混雜；同時在種子流通過程中，也可能會出現外來種子混入或人為摻假造成的機械混雜，不僅給生產帶來了重大損失，也制約了甜瓜雜交種的推廣應用。此外，個別不法分子為牟取暴利，甚至盜用育種者的親本材料繁種銷售，大大侵害了育種單位和育種者的合法知識產權。因此，尋找一種快速有效地鑒定甜瓜雜交品種/組合真實性和純度的方法十分必要。

傳統的大田形態鑒定法仍是目前最常用的方法。該法鑒定結果雖較為可靠，但周期長，花費大，占用土地，受季節限制，秋季鑒定往往要利用溫室或到海南等氣候適宜的地方進行，而且很多性狀的表現易受栽培措施及環境因子的影響；鑒定者的觀察經驗也制約著鑒定的準確性；隨著大量新品種的不斷涌現，又增加了形態鑒定的難度。因此該法不能有效地起到“打假”的作用。

九十年代，我國不少學者曾利用蛋白質、同工酶電泳技術對甜瓜雜交種進行鑒定。該法可在室內進行，易于早期識別。但是同工酶和蛋白質都是基因表達的產物，都是對基因的間接反應，多態位點有限，且易受發育階段和表達器官的影響，條件要求嚴格，不易控制。再者，它們的提取過程復雜，尤其是同工酶，需要低溫操作，耗時長，成分數量不穩定，難以提取，不易對大量樣本進行分析。

隨著分子生物學的飛速發展，各種DNA分子標記技術也相應問世。美國科學家Williams等建立的RAPD(Random?Amplified?Polymorphic?DNA)技術是發展較早的分子標記技術之一，由于該技術具有操作簡便，速度快，費用低等優點，特別是它可以對無任何分子生物學基礎的物種展開研究，因此倍受青睞。閆鵬等從100條RAPD引物中篩選到在2個甜瓜雜種一代及其親本間呈現多態性的特異引物，可用于其純度鑒定(《甘肅農業大學學報》，2007，42(2)，43～46)。樂錦華等利用20個隨機引物對厚皮甜瓜8個親本與4個雜交種進行RAPD分析，發現10個引物的擴增譜帶具有多態性，親本具有各自的特異譜帶，絕大部分F₁的譜帶是雙親互補帶，可用于親緣關系及純度的鑒定(《果樹科學》，2000，17(4)，295～299)。劉富中等(2002)從80個隨機引物中選出5個可鑒定3個甜瓜雜交種的純度，其中OPM17可同時用于3個甜瓜雜種的純度鑒定(《中國蔬菜》，2002(5)，7～9)。由于RAPD技術穩定性、重復性較差，鑒定結果的準確度會大受影響。再者，利用分子標記技術鑒定甜瓜雜交種的真偽目前還處于空白階段。

發明內容

本發明使用了RAPD-SCAR分子標記及相關分子生物學技術，目的旨在建立一套快速、準確地鑒定甜瓜雜交種純度及真偽的新方法。

本發明公開了一種甜瓜(Cucumis?melo?L.)雜交種的鑒定方法，包括利用特異雙引物GGGATATCGGAAGGT和GGGATATCGGGAATA對樣本的基因組DNA進行PCR擴增。

上述甜瓜(Cucumis?melo?L.)雜交種為‘東方蜜2號’。上述特異雙引物為針對甜瓜(Cucumis?melo?L.)雜交種‘東方蜜2號’的特異RAPD標記序列設計的。較佳的，上述樣本的基因組DNA為植物幼苗的基因組DNA。

上述鑒定方法還包括：根據PCR后439bp的DNA條帶的有無對甜瓜(Cucumis?melo?L.)雜交種的純度及真實性進行鑒定。

本發明的鑒定方法中，特異性引物通過下列方法篩選獲得：采用200條RAPD引物對甜瓜(Cucumis?melo?L.)雜交一代品種‘東方蜜2號’及其親本和7個同母異父的雜交組合進行一系列的分子生物學技術處理和實驗分析，并篩選到‘東方蜜2號’的特異RAPD標記，對RAPD標記進行克隆和測序，根據測序結果設計并合成特異性PCR(PolymeraseChain?Reaction)引物，并對該引物的特異性進行驗證。最后利用該SCAR標記對甜瓜(Cucumis?melo?L.)雜交種‘東方蜜2號’進行真偽及純度鑒定。

篩選具體過程如下：