[發(fā)明專利]一種用于評(píng)估硝酸甘油類藥物治療心絞痛療效的檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810042629.7
• 申請(qǐng)日: 2008-09-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101349634A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 傅詠南;張奕;張同燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海中優(yōu)醫(yī)藥高科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N21/00
• 分類號(hào): G01N21/00;G01N33/15;C12Q1/68
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司
• 代理人: 翁若瑩

1.一種用于評(píng)估硝酸甘油類藥物治療心絞痛療效的檢測(cè)方法，其方法為：

步驟1.檢測(cè)的樣品類型與采樣方法：

用采樣拭在30個(gè)被測(cè)者口腔中分別左右兩腮至少需要各上下刮45次，以保證采集到足量的細(xì)胞樣本；

步驟2.基因組DNA的抽提方法：

采用硅膠吸附法抽提每一個(gè)口腔上皮細(xì)胞樣本的基因組DNA，時(shí)間為2小時(shí)，共抽提30個(gè)被測(cè)者樣本，并用肉眼可見(jiàn)清晰白色條帶即可判斷獲得的DNA能進(jìn)入下一步檢測(cè)；

步驟3：熒光定量PCR反應(yīng)

將每一個(gè)被測(cè)者樣本分別放入1個(gè)反應(yīng)孔，檢測(cè)線粒體乙醛脫氫酶ALDH2Glu504Lys?SEQ?ID?NO1：rs671位點(diǎn)基因多態(tài)性，30個(gè)被測(cè)者樣本就有30個(gè)反應(yīng)孔，并增設(shè)2個(gè)不含DNA模版的NTC空白對(duì)照孔；

在每一個(gè)反應(yīng)孔中加入試劑為熒光定量PCR反應(yīng)體系，總體積為10μl，即濃度為20ng/μl的DNA模板2μl、1μl?10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液ABIMGB、0.1μl?25mM?d?NTP合成DNA的四種脫氧核苷酸底物、0.5μl?25mM?MgCl2溶液、0.02μl(5units/μl)Taq?DNA聚合酶、20μM的有義引物1和2各0.225μl、20μM的反義引物1和2各0.225μl、10μM的熒光探針1和2各0.25μl，去離子水5.43μl；采用5個(gè)位點(diǎn)的正向引物、反向引物、VIC熒光探針和FAM熒光探針工具進(jìn)行檢測(cè)；本發(fā)明位點(diǎn)的基因分型可以根據(jù)下表的引物和探針設(shè)計(jì)，采用-MGB技術(shù)，進(jìn)行檢測(cè)試劑合成；

將32個(gè)反應(yīng)孔在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，先進(jìn)行預(yù)熱：50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，然后再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95℃、30秒，60℃、1分鐘檢測(cè)，經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，基因分型的準(zhǔn)確率達(dá)到了99％以上，重復(fù)性達(dá)到了100％。

反應(yīng)結(jié)束后取出后再放入ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，并自動(dòng)將30個(gè)被測(cè)者樣本和2個(gè)NTC的檢測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)號(hào)入座到圖1中，即線粒體乙醛脫氫酶ALDH2?Glu504Lys?SEQ?ID?NO1：rs671圖；

步驟4數(shù)據(jù)讀取

將ABI7900型熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號(hào)的圖和NTC空白對(duì)照進(jìn)行比較，理論上存在三種不同的信號(hào)，純VIC熒光信號(hào)、VIC和FAM雜合熒光信號(hào)以及純FAM熒光信號(hào)，分別代表該位點(diǎn)三種不同的基因型；如圖1?ALDH2?Glu504Lys?SEQ?ID?NO1：rs671所示

在檢測(cè)結(jié)果圖中，共有32個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)被測(cè)者樣本或NTC的檢測(cè)結(jié)果，坐標(biāo)軸(X：0.0-0.1?Y：0.2-0.3)區(qū)域?yàn)镹TC空白對(duì)照、坐標(biāo)軸(X：0.05-0.2Y：1.2-1.4)區(qū)域?yàn)镚G基因型、坐標(biāo)軸(X：0.45-0.6?Y：0.9-1.1)區(qū)域?yàn)镚A基因型、坐標(biāo)軸(X：0.6-0.8?Y：0.3-0.5)區(qū)域?yàn)锳A基因型；其中，攜帶GA基因型時(shí)酶的活性顯著降低，攜帶AA基因型時(shí)酶的活性幾乎完全喪失；

步驟5.結(jié)果分析

5-1檢測(cè)結(jié)果為GG

您的ALDH2?Glu504Lys基因型為GG，為正常基因型，在沒(méi)有其他特殊環(huán)境因素以及特殊基因變異情況的影響下，不會(huì)影響硝酸甘油類藥物的有效率；5-2檢測(cè)結(jié)果為AG；

您的ALDH2?Glu504Lys基因型為GA，根據(jù)現(xiàn)有研究表明該基因型的酶活性低于GG基因型，與攜帶GG基因型的人群相比，攜帶AG的基因型的人群硝酸甘油類藥物有效率有所降低，強(qiáng)烈建議您在醫(yī)生指導(dǎo)下謹(jǐn)慎使用硝酸甘油類藥物治療心絞痛；

5-3檢測(cè)結(jié)果為AA

您的ALDH2?Glu504Lys基因型為AA，根據(jù)現(xiàn)有研究表明該基因型的酶活性幾乎完全喪失，與攜帶GG基因型的人群相比，攜帶AA的基因型的人群硝酸甘油類藥物有效率顯著降低甚至完全失效，強(qiáng)烈建議您在醫(yī)生指導(dǎo)下謹(jǐn)慎使用硝酸甘油類藥物治療心絞痛。