[發明專利]腸道病毒71型核酸擴增液態芯片檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200810042338.8
• 申請日: 2008-09-01
• 公開（公告）號: CN101665839A
• 公開（公告）日: 2010-03-10
• 發明（設計）人: 朱文斯
• 申請（專利權）人: 上海佑安生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海天翔知識產權代理有限公司
• 代理人: 王 裕

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種腸道病毒71型的檢測試劑盒。

背景技術

腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)成員。EV71感染主要引起患者手足口病(HFMD)，并且是該病的主要病原體。另外，EV71還可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹等多種神經系統相關疾病，并可暴發流行，導致死亡，嚴重危害人類健康。

為了在EV71相關疾病暴發時能夠迅速查明病因，從而及時采取正確、有效的控制措施，亟需針對EV71的準確、快速、高靈敏度、高特異性、高通量的新型診斷手段。腸道病毒感染具有“一因多病，一病多因”的特點，僅根據臨床癥狀不易做出正確的診斷。例如，引發手足口病的腸道病毒就有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型均為手足口病較常見的病原體，其中以腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型(Coxsakie?A16，簡稱CoxA16)最為常見。腸道病毒的傳統檢測方法是病毒分離、血清中和試驗和分子生物學診斷技術。病毒分離操作復雜、耗時長、費用高、分離率低。免疫學方法雖然比分離培養法更加簡便、快速，但是整個檢測時間仍需1周左右的時間。病人感染病毒后，血清中產生特異性抗體需要一段時間。另外，EV71感染后只有2～10天(平均3～5天)的潛伏期，而傳染力始于發病的前幾天，所以免疫學方法敏感度較低，尤其不適合早期診斷。毒株抗原變異、抗原抗體交叉反應、患者個體差異等均在較大程度上影響了該法的準確性與特異性。近年來，聚合酶鏈式反應(PCR)技術廣泛應用于病毒特異性基因的檢測，盡管它也具有靈敏、特異、快速的優點，但結果判定需要電泳，且反應產物容易產生污染而導致假陽性。

由此可見，目前常用的腸道病毒71型檢測手段均存在較大的不足，不能滿足疾病暴發時對大量臨床樣本，尤其是早期樣本準確、快速診斷的要求。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是現有腸道病毒71型檢測手段均存在較大的不足的問題

為了解決上述問題，本發明公開了一種腸道病毒71型核酸擴增液態芯片檢測試劑盒，包括：

一對EV71基因組特異性引物A和A’，其中A和/或A’的5’端標記有生物素；

一對EV71基因組特異性引物B和B’，其中B和/或B’的5’端標記有生物素；

一種交聯與引物A和A’擴增片段序列配對的探針E的熒光編碼微球C；

一種交聯與引物B和B’擴增片段序列配對的探針F的熒光編碼微球D；

QRT-PCR試劑；

熒光物標記的親和素。

本發明中，定義“EV71基因組特異性引物”是指以GeneBank中已公開的EV71核酸序列為模板，本領域技術人員通過公知的引物設計軟件得到針對EV71基因組特異性引物序列，相應的引物可以通過核酸合成儀制備得到。本發明中所述引物A和A’、B和B’的序列均不相同。

在一實施方式里，所述的熒光編碼微球C為luminex公司的144微球。

在一實施方式里，所述的熒光編碼微球D為luminex公司的146微球。

在一些實施方式里，所述熒光物標記的親和素中熒光物選自異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、藻紅蛋白、3價鑭系螯合物如銪(Eu³⁺)、鋱(Tb³⁺)、鈰(Ce³⁺)等中之一，其中優選藻紅蛋白。

在一些實施方式里，所述的熒光基團是FAM，TET，VIC，或HEX。

在一實施方式里，所述的EV71特異性引物A和A’的核苷酸序列為5’-GCGGGTAGTGTGTCGTAAC-3’(SEQ?ID?NO：4)和5’-GGTGGTCACAGACTTCAAGGTT-3’(SEQ?ID?NO：5)；所述與引物A和A’擴增片段序列配對的探針E的核苷酸序列為5’-NH-TTTTTTGGATTGGCCATCCGGTGTGCA-3’(SEQ?ID?NO：6)。

在一實施方式里，所述的EV71特異性引物B和B’的核苷酸序列為5’-GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3’(SEQ?ID?NO：7)和5’-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3’(SEQ?ID?NO：8)；所述與引物B和B’擴增片段序列配對的探針F的核苷酸序列為5’-NH-TTTTTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAC-3’(SEQ?ID?NO：9)。