[發明專利]人丙肝病毒的人工假病毒及其制備和應用

有效

• 申請號: 200810041872.7
• 申請日: 2008-08-19
• 公開（公告）號: CN101372683A
• 公開（公告）日: 2009-02-25
• 發明（設計）人: 張鋆;邵俊斌
• 申請（專利權）人: 上海之江生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/867;C12N5/10;C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海光華專利事務所
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及人丙肝病毒的人工假病毒。

背景技術

HCV檢測時，有以下三個主要步驟需要陽性參照：

1.從標本中提取HCV?RNA，包括：病毒外膜、核衣殼打開/破碎，核酸釋放。

2.HCV?RNA被逆轉錄(也稱反轉錄)為cDNA。

3.cDNA與PCR反應液和DNA多聚酶混合，在PCR儀中擴增并得到信號。

現有的陽性參照，主要有下述幾種來源：病人血清(/血制品)；體內或體外轉錄RNA； 質粒或化學合成。

所有陽性參照中，最準確貼切的陽性參照應該是含該HCV病毒的天然樣本(如病人血 液、肝組織)，同質性可充分保證其作為前述三個步驟的陽性參照，但其缺陷在于天然樣本 來源少，且由于含有天然病毒，因此具有傳染性和危害性。

要克服天然病毒來源少且具有傳染性的缺點，本質上可通過離體培養來解決，即把 HCV(尤其是基因組經過無害化改造的HCV)導入合適的人工培養宿主細胞系，重組HCV顆粒 即可從細胞中產生并分泌至培養基上清。然而，該技術的關鍵步驟為保密狀態，目前只為 少數實驗室所擁有；另一方面，這種HCV生產方法可能尚存在若干缺陷，如成本高、病毒 數量仍然較低、結構不天然、重復性差等。

體外轉錄的HCV?RNA，因為它與標本中待測指標一樣，都是RNA，因此可以作為逆轉錄 的陽性參照；但是，由于其不具備病毒外殼，因此不適合作為從標本中提取病毒RNA操作 的陽性參照。

用質粒作為陽性參照，其優點是制備純化容易，但由于質粒是閉合環狀超螺旋雙鏈形 式，非單線性，不是RNA，因此它只能作為PCR參照，而無法作為RNA提取和逆轉錄的參照。

至于化學合成法制備RNA陽性參照，目前技術尚不成熟，且成本高，還會因為沒有核 衣殼、膜的保護而容易降解，因此到目前為止還無實際應用的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種易于獲得，安全，廉價的人丙肝病毒的人工假病毒，其制備 及應用。

假病毒即指反轉錄病毒載體，為經過基因改造的反轉錄病毒，具有原始病毒的基本結 構和部分生活史，而不具有多數調節基因及主要致病成份。所謂基本結構，乃假病毒的外 膜蛋白及脂類、衣殼蛋白、復制酶(起切割、逆轉錄、整合作用的蛋白)、RNA基因組，分別 由來源于天然病毒的env、gag、pol、目的基因(序列)所編碼/代表。所謂部分生活史，乃 假病毒僅可在宿主細胞中產生組件、組裝，且只能一次性的感染靶細胞，不產生新病毒。

本發明利用反轉錄病毒系統(Clontech公司的RetroX^(R)system)，將經篩選獲得的目 的DNA片段重組(分子生物學常規技術)入pLXSN(plasmid-LTR-X-SV40promoter-Neomycin) 質粒載體，然后導入(方法：脂質體轉染)病毒生產細胞(Clontech公司的PT67)，攜帶目的 序列(以RNA形式)的假病毒便可以從生產細胞中產生，分泌到液態的培養基中。收集此培 養基，2000RPM離心10分鐘去除大部分細胞碎片和雜質，就得到假病毒粗制品。

RetroX^(R)system反轉錄病毒系統包括PT67生產細胞、2種克隆載體pLXSN和pLNCX2 供選擇、載體附帶正反向測序引物、正對照克隆(AP基因)質粒pLAPSN，即X＝AP，Alkaline phosphatase(堿性磷酸酯酶報告基因)。PT67細胞來源于常見的小鼠胚胎成纖維細胞系NIH 3T3，已經穩定轉染了莫洛尼逆轉錄病毒(Mo-MLV，Moloney?murine?leukemia?virus，莫洛尼 株型鼠科白血病病毒)的gag-pol基因，10A1逆轉錄病毒(10A1-MLV，10A1株型鼠科白血病病 毒)的env基因(也稱10A1)，形成穩定轉染(整合入細胞染色體)的輔助篩選基因分別是TK gene(thymidine?kinase，胸腺激酶)和DHFR?gene(dihydrofolate?reductase，二氫葉酸還 原酶)。采用RetroX^(R)system反轉錄病毒系統制作反轉錄病毒的步驟為：把目的序列重組 進某一載體，擴增重組質粒，轉染PT67細胞，收獲上清。

本發明第一方面公開了一種人丙肝病毒的人工假病毒，為反轉錄病毒，由pLXSN質粒 載體所轉化的PT67細胞產生，其中，pLXSN質粒載體含有SEQID?NO：1的多核苷酸序列。