[發明專利]萘雙加氧酶植物表達載體及其構建方法和應用

無效

• 申請號: 200810041089.0
• 申請日: 2008-07-28
• 公開（公告）號: CN101333541A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 彭日荷;姚泉洪;熊愛生;薛永;高峰;付曉燕;田永生;趙偉;孫廣東;金曉芬
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/62;B09C1/00;B09C1/10
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司
• 代理人: 費開逵

技術領域

本發明屬于植物遺傳育種領域，尤其涉及帶有惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)萘雙加氧酶基因序列表達載體的構建，更具體的涉及利用農桿菌(Agrobacterium?tumefaciens)將萘雙加氧酶基因表達載體轉化到植物中，從而促使植物對萘的降解。

背景技術

多環芳烴(Polycyclic?Aromatic?Hydrocarbons，PAHs)及其衍生物是一類廣泛存在于環境中的有機污染物。多環芳烴含有兩個或兩個以上苯環的碳氫化合物，可分為芳香稠環和非芳香稠環型，環境污染研究中的多環芳烴一般是指芳香稠環型，其中16種多環芳烴化合物已被美國環保局列入優先控制的污染物黑名單。多環芳烴大多是石油、煤等化石燃料以及木材、?天然氣、有機高分子化合物、紙張、作物秸稈和煙草等含碳氫化合物的物質經不完全燃燒或在還原性氣氛中經熱分解而生成的，PAHs環數相對豐度可以反映來自熱解或石油類污染，通常4環及4環以上PAHs主要來源于化石燃料高溫燃燒，而2環和3環PAHs則來源于石油類污染。一般而言2-3環的低分子量PAHs具有顯著的急性毒性，而某些高分子量的PAHs則具有潛在的致癌性，有很強的致畸、致癌和致突變作用。

近些年，隨著我國工業化進程的加快，土壤中多環芳烴(PAHs)的污染程度越來越重，工業發達地區尤為突出。由于土壤有機質對PAHs具有很強的吸附作用，有機質含量高時PAHs易富集，有機質含量與PAHs殘留量存在顯著相關性。土壤中多環芳烴污染的主要途徑有污水灌溉、大氣沉降、廢物傾倒和工業漏滲。多環芳烴化合物(PAHs)由于水溶性差，辛醇-水分配系數高，常被吸附于土壤顆粒上。因此，該類化合物易于從水中分配到生物體內、沉積層中，土壤就成為PAHs的主要載體。多環芳烴在環境中不斷積累，其半衰期從幾個月到幾年不等。多環芳烴進入土壤后，由土壤表面污染進一步導致下層土壤污染，甚至地下水污染。

治理多環芳烴化合物(PAHs)污染主要有物理修復、化學修復和生物修復。同其它有機污染物相比，多環芳烴化合物在土壤中比較穩定，利用促使其揮發和降解的物理化學方法很難去除，國內外正在篩選高效的吸附劑及臭氧化降解途徑。近年來，生物修復技術為PAHs的降解提供了新的途徑，生物降解在污染物的遷移轉化直至最終消失的過程中占重要地位(Berardez?et?al?Environmental?Science?&?Technology?2004，15：5878-5887)。

生物修復(Bioremediation)的基礎是自然界中微生物對污染物的生物代謝作用，因此早期的生物修復主要指微生物修復。微生物修復已經發展出一系列技術，如：現場處理、就地處理和生物反應器，其中生物反應器在修復多環芳烴污染的土壤中研究較多。許多細菌、真菌和藻類自身都有一定的降解PAHs的能力，因此在PAHs污染的土壤中，經過自然馴化，可以找到大量的能降解多環芳烴的微生物。近年來人們對降解多環芳烴的微生物進行了廣泛的研究，常見微生物有紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、分枝桿菌(Mycobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、拜葉林克氏菌屬(Beijernckia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、藍細菌(Cyanobacteria)、微球菌屬(Micrococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)和弧菌屬(Vibrio)等。

由于微生物種類不同以及多環芳烴較難在環境中降解，所以降解PAHs的途徑就有較大的差別。微生物產生加氧酶的能力決定了多環芳烴的降解程度。多環芳烴的最初氧化，即苯環加氧是控制PAHs生物降解反應速度的關鍵步驟。其中，對好氧細菌降解多環芳烴的研究主要集中在假單胞菌的萘降解途徑的分析上。以此為例，假單胞菌是通過羥基化作用分解萘，該過程由萘雙加氧酶(naphthalene?dioxygenase?NDO?EC：1.14.12.12)系統的參與。目前對該酶的研究結果主要來自惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)G7菌株，該菌中萘加氧酶(EC：1.14.12.12)系統的三個組分分別是：鐵硫黃素蛋白還原酶NahAa(EC：1.14.12.12)、鐵氧還蛋白NahAb和加氧酶(EC：1.14.12.12)，加氧酶由大亞基NahAc和小亞基NahAd組成四聚體，電子從NAD(P)H通過鐵硫黃素蛋白還原酶和鐵氧還蛋白向加氧酶傳送，促進加氧酶將兩個氧原子加到萘的一個苯環上。