[發(fā)明專利]一種脫氧核苷三磷酸的分離提純方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810040986.X
• 申請日: 2008-07-25
• 公開（公告）號: CN101633681A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 段梅莉;辛秀娟;鮑杰;冀亞飛;英智威;李慧
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C07H19/20
• 分類號: C07H19/20;C07H19/10;C07H1/06
• 代理公司: 上海翼勝專利商標(biāo)事務(wù)所（普通合伙）
• 代理人: 翟 羽

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，具體地說，是一種廣泛使用的脫氧核苷三磷 酸(dNTP)酶法合成產(chǎn)品的分離提純方法。

【背景技術(shù)】

通常對脫氧核苷單磷酸(dNMP)合成脫氧核苷三磷酸(dNTP)的生物合成反 應(yīng)液，采用沉降操作使生成的dNTP以鋇鹽的形式被分離出來，如用溴化鋇水 溶液使dNTP從反應(yīng)液中分離出來的沉降分離、再使用離子交換樹脂洗脫 dNTP，使其成為dNTP水溶液的反復(fù)沉降洗脫的分離提純方式，或者將dNTP 的生物合成反應(yīng)液直接用離子交換樹脂填充柱洗脫，再用高壓液相色譜分離 提純的方法手段。

現(xiàn)有對dNTP的生物合成反應(yīng)液分離提純的方法，獲得高純度的dNTP產(chǎn) 品(含量在98％以上)必需使用液相色譜進(jìn)行分離，分離速度慢，流動相溶 劑耗用量大，無法滿足大批量工業(yè)化生產(chǎn)的需要，而且由于使用毒性重金屬 離子水溶液以及離子交換樹脂，相應(yīng)需要非常大量的水溶液對它們的使用進(jìn) 行處理，這些處理勢必帶來嚴(yán)重的水資源污染和水處理工藝機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)的高能 耗等，以上技術(shù)方法是造成dNTP產(chǎn)品非常高昂價格的重要原因。

脫氧核苷三磷酸(dNTP)包括四種組分：脫氧核苷三磷酸(dNTP)產(chǎn)品包括 脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)、脫氧胞苷三磷酸(dCTP)和 脫氧胸苷三磷酸(dTTP)。dNTP是DNA生物合成過程中必不可缺的中間體， 它具有商業(yè)性，但是價格非常昂貴，如美國SIGMA公司dATP的價格高達(dá) 250.5美元/100mg(含量97％以上，2006～2007價格目錄)。目前市場上存在 的dNTP生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法以及酶合成法；與化學(xué)法相比，酶合成法 可降低可觀的成本，有著更好的經(jīng)濟(jì)性以及環(huán)保性。dNTP的合成需要兩個酶 的磷酸化反應(yīng)，即從脫氧核苷單磷酸鹽dNMP轉(zhuǎn)化為脫氧核苷二磷酸dNDP， 進(jìn)而再轉(zhuǎn)化為dNTP的過程。20世紀(jì)80年代，美國著名的科學(xué)家Whitesides 成功開發(fā)了四種dNTP中的一種dATP的酶合成法，將1-mmol以下規(guī)模的 dATP生產(chǎn)擴(kuò)展到了200-mmol的大批量生產(chǎn)；他們將dATP從生物合成反應(yīng) 混合液中以其鋇鹽形式離析出來，初步提純可達(dá)到60％的純度；進(jìn)一步用離 子交換樹脂進(jìn)行洗脫提純可使dATP達(dá)到95％的純度。高純度的dATP(含量 在98％以上)對cDNA合成、測序和標(biāo)記等反應(yīng)的成功非常重要，但是高純 度產(chǎn)品的獲得通常需要用高壓液相色譜進(jìn)行操作，耗時費(fèi)力，液料使用排放 量大，污染嚴(yán)重。dATP產(chǎn)品的分離提純長期以來是一個瓶頸問題，如何使合 成制造的途徑更方便更經(jīng)濟(jì)，使其用于DNA合成以及其它生物材料合成，成 為長期以來人們研究的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種脫氧核苷三磷酸的分 離提純方法，可避免使用毒性金屬離子水溶液和離子交換樹脂，以及由此帶 來的大量的水處理工藝缺陷，從而降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種脫氧核苷三磷酸的分離提純方法，其包含對脫氧核苷三磷酸產(chǎn)品中 的脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸和脫氧胸苷三磷酸的 分離提純方法，其步驟為，

(1)首先，在溫度為4℃以下時，將脫氧核苷三磷酸生物合成反應(yīng)液直 接用有機(jī)溶劑沉降，脫氧核苷三磷酸生物合成反應(yīng)液與有機(jī)溶劑的體積比為 1∶1～1∶25，優(yōu)選為1∶4～1∶15，得到脫氧核苷三磷酸的固形混合物；

(2)其次，在溫度為4℃以下時，將步驟(1)得到的固形混合物用超純 水溶解，用鹽酸酸性水溶液調(diào)整pH值為0.1～2，優(yōu)選為0.5～1.5，再用有機(jī)溶 劑沉降，得到純度95％以上的脫氧核苷三磷酸固形物；然后再將該固形物用 少量超純水溶解，再用氫氧化鈉堿性水溶液調(diào)整pH值為5～11，優(yōu)選為7.0～9.0， 液氮冷凍并進(jìn)行冷凍干燥，得到脫氧核苷三磷酸鈉鹽產(chǎn)品；

所述的有機(jī)溶劑為無水乙醇或者異丙醇中的一種，優(yōu)選為無水乙醇。

本發(fā)明一種脫氧核苷三磷酸的分離提純方法的積極效果是：

(1)本發(fā)明避免使用了毒性的鋇鹽水溶液沉降dNTP生物合成反應(yīng)液， 并且避免使用離子交換樹脂分離提純，從而避免由這些操作所帶來的水處理 工藝高能耗的缺陷；