[發明專利]一種RhoGDI2基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應用

有效

• 申請號: 200810040824.6
• 申請日: 2008-07-22
• 公開（公告）號: CN101328499A
• 公開（公告）日: 2008-12-24
• 發明（設計）人: 張云福;裘建英
• 申請（專利權）人: 芮屈生物技術（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/53
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所
• 代理人: 翟羽

技術領域

本發明涉及一種試劑盒，具體地說關于一種RhoGDI2基因的原位雜交 檢測試劑盒及其檢測方法和應用。

背景技術

根據國內外權威機構提供的資料，我國每年癌癥的新增人數170萬， 死亡人數近160萬，患者600多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡 人數接近800萬，患者約有8400多萬人，到2020年以上人數將翻一番， 這是一組可怕的數字。

2005年美國衛生研究院、癌癥研究院、疾控中心等多家單位做了一個 年度報告，“認為人類在抗癌大戰中是失敗”，也就是說癌癥死亡率沒有降 低，其列舉出造成抗癌大戰失敗的幾個因素是：1、腫瘤細胞異質性；2、 腫瘤細胞耐藥性；3、抗癌藥物設計思路不完善等。同時，該報告中亦提 出應重新審視現有診治癌癥的措施。本發明人在研究中發現，導致癌癥死 亡率不降的另二個重要原因是：1、不能做到真正的早期診斷；2、轉移的病 理機制不清楚。依照傳統的醫學影像及和其它生化(如蛋白標記物)指標 來診斷癌癥，認為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷(更小些 有時無癥狀體征)，這一臨床概念值得認真討論。影像醫學的2公分以下 癌塊屬早期這一界定科學性是不夠嚴謹的，從細胞學角度，1公分的腫塊 約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數遠不止2億 個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產生及形成2公分的癌塊，其病 理演變過程相當長，可能是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實的是在 這個過程中，腫塊是癌癥唯一的發生地和單獨的病灶。臨床上已證實：一 旦形成腫塊的同時，其他癌細胞通過不同途徑遷移到其他部位克隆生長； 一旦切除原發灶后，其他器官復發灶或多發癌塊灶先后形成或轉移。因此， 在臨床上以2公分以下的腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹(有些病例， 在發現原發病灶時，同時發現轉移病灶，不在我們表述的內容中)，這時 已經是晚期了，這是導致癌癥死亡率不降的真正原因。

隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的 深入展開，至今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌 變前期或癌細胞形成(單克隆)時或癌細胞突破血管壁早期轉移時，就能 做到早期預測診斷。

弗吉尼亞大學的泌尿學與分子生理學教授Dan?Theodorescu 博士領導的科學小組研究表明，RhoGDI2基因與膀胱癌細胞轉移 有關系，當RhoGDI2基因在癌細胞中有活性時，細胞就產生一種 能夠阻止癌細胞浸入到其他器官的蛋白。

目前對RhoGDI2基因的研究都采用高通量基因芯片技術，而這些方法 多用于科研方面，不適應臨床應用，特別是個性化的應用在我國現階段條 件尚不成熟。

原位雜交技術(in?situ?hybridization)是將分子生物學與細胞化 學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性 核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探 針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交，再 以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位 顯示特異的DNA或RNA分子。

原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分 子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按 核酸性質不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸 探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于以后的檢 測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位 素標記物有3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底 較為清晰等優點，但是由于放射性同位素對人和環境均會造成傷害，近來 有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地 高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。

根據所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為 DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經過 五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和顯示。

中國專利文獻CN1556410公開了“一種魚類病毒的檢測試劑盒及其 檢測方法”。中國專利文獻CN1680597公開了“一種用于定量檢測丙型肝 炎病毒(HCV)的熒光定量PCR試劑盒”。中國專利文獻CN2918435，公開了 “一種檢測肥胖相關基因SNP的寡核苷酸芯片及試劑盒”。但是，關于 RhoGDI2基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測技術未見報道。