[發(fā)明專利]增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810040136.X
• 申請日: 2008-07-03
• 公開（公告）號: CN101314767A
• 公開（公告）日: 2008-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郝曉南;趙珺;章永泰
• 申請（專利權(quán)）人: 上海天生生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;C12P21/04
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1、一種增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液，其特征在于，組分和重量百分比為：

MEM：56.5％-64.7％；

RPMI-1640：29.4％-30.4％；

Hanks：5.88％-13.0％；

人類干細(xì)胞生長因子-2：470×10^-9％-1740×10^-9％；

人類干細(xì)胞生長因子：1.9×10^-9％-2.8×10^-9％；

人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子：2.0×10^-9％-2.9×10^-9％；

CD135配體蛋白：9.4×10^-9％-10.8×10^-9％；

人類促紅細(xì)胞生成因子：1.4×10^-9％-2.4×10^-9％；

人類上皮細(xì)胞生成因子：9.4×10^-9％-10.8×10^-9％；

人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b：9.4×10^-9％-10.8×10^-9％。

2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液，其特征是，組分和重量百分比為：

MEM：59.36％-61％；

RPMI-1640：29.7％-30.14％；

Hanks：9.3％-10.5％；

人類干細(xì)胞生長因子-2：850×10^-9％-1260×10^-9％；

人類干細(xì)胞生長因子：2.1×10^-9％-2.5×10^-9％；

人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子：2.2×10^-9％-2.6×10^-9％；

CD135配體蛋白：9.8×10^-9％-10.4×10^-9％；

人類促紅細(xì)胞生成因子：1.7×10^-9％-2.1×10^-9％；

人類上皮細(xì)胞生成因子：9.7×10^-9％-10.4×10^-9％；

人類促成纖維細(xì)胞生成因子-b：9.6×10^-9％-10.4×10^-9％。

3、一種如權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備方法，其特征是，包括以下步驟：

①按所述比例取MEM、RPMI?1640、Hanks混合后，充分?jǐn)嚢瑁频没A(chǔ)培養(yǎng)液；

②按所述比例再取人類干細(xì)胞生長因子-2、人類干細(xì)胞生長因子、人類粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、CD135配體蛋白、人類促紅細(xì)胞生成因子、人類上皮細(xì)胞生成因子、人類成纖維細(xì)胞生成因子-b依次加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分?jǐn)嚢杈鶆颉⑷芙猓?/p>

③將胎肝間充質(zhì)細(xì)胞分離，將純化出的間充質(zhì)細(xì)胞，根據(jù)計(jì)數(shù)器的讀數(shù)取10⁷個(gè)胎肝間充質(zhì)細(xì)胞置入培養(yǎng)瓶，加入DMEM培養(yǎng)液和2％人血清進(jìn)行培養(yǎng)，然后將上清液抽出，進(jìn)行沖洗，

進(jìn)一步加入DMEM培養(yǎng)液和5％人血清與胎肝間充質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶內(nèi)混合，連續(xù)培養(yǎng)將上清液全部收集，

上清液經(jīng)過過濾后，再經(jīng)過離心，將全部細(xì)胞碎片及非溶解性的物質(zhì)去除，制得條件培養(yǎng)液；

④將條件培養(yǎng)液與MEM混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笮纬苫旌吓囵B(yǎng)液，利用碳酸氫鈉將混合培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)至7.40～7.45，經(jīng)過過濾即可制得干細(xì)胞CD34增強(qiáng)表達(dá)培養(yǎng)液。

4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備方法，其特征是，步驟③中所述的胎肝，是指：取19-20周標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)后的人類胎肝。

5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備方法，其特征是，步驟③中所述的2％人血清進(jìn)行培養(yǎng)，是指：經(jīng)10-14天的培養(yǎng)，

6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的增強(qiáng)胎肝造血干細(xì)胞CD34表達(dá)的培養(yǎng)液的制備方法，其特征是，步驟③中所述的將上清液抽出后，用Hanks對培養(yǎng)瓶中的胎肝間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗二次。