[發明專利]檢測HPV的方法及Phi29DNA聚合酶在檢測HPV中的應用

無效

• 申請號: 200810040005.1
• 申請日: 2008-07-04
• 公開（公告）號: CN101619364A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發明（設計）人: 張艷;管愛民;顧關林;馬式薇;何昕;李寧麗;黃立東;姜惠明;王利;沈佰華;蔡佩明;陳勇
• 申請（專利權）人: 上海市免疫學研究所;上海多納美企業發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 上海衡方知識產權代理有限公司
• 代理人: 卞孜真;金重慶

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，尤指一種檢測HPV的方法以及其它Phi29DNA聚合酶在檢測病毒中的應用。

背景技術

宮頸癌在全球婦女的癌癥死因中高居第二位，世界上每年的新發病例約為45萬，死亡率為50％。Drs.Rous?and?Beard最早在1934曾經提出HPV為致癌物質，此后自1974年Zur?Hausen提出HPV是宮頸癌的最可能因素后，國內外學者就HPV感染與子宮頸癌的關系進行了大量的研究，并獲取了許多實驗室與臨床證據。1977年Laverty在電鏡中觀察到子宮頸癌活檢組織中存在HPV顆粒，1981年第一次在生殖道分離出了HPV，1983-1986年依次從宮頸癌樣本中分離出HPV16、18、31、35等型別。1995年IARC專題討論會確定：HPV感染是子宮頸癌的主要病因。目前研究發現99.7％的宮頸鱗狀細胞癌有人乳頭瘤病毒的感染，而高危型人乳頭狀瘤病毒的持續感染是宮頸癌發病的重要因素。

人乳頭瘤病毒(Human?Papillomaviruses，HPV)屬乳多空病毒科A亞群內的一組DNA病毒，外形呈20多面體對稱型，無包膜，直徑約45nm～55nm，基因組為共價閉合環狀雙鏈DNA分子，含近8000個堿基對(bp)。HPV基因組含8個開放讀碼框架；可分為三個基因區，包括兩個編碼區和一個非編碼調控區。編碼區分為E區和L區，E區包括E1、E2、E4、E5、E6、E7；L區包括L1、L2，分別編碼早期蛋白和晚期蛋白，六個E蛋白主要負責病毒DNA的復制、轉錄和細胞轉化，兩個L蛋白為衣殼蛋白主要負責病毒顆粒的組裝和DNA包裝。

當分離株病毒L1區序列與已知序列近源病毒株同源性少于90％時，就可被確定為一種新的HPV型別，按照HPV亞型與癌癥相關性的高低將HPV分為高危型和低危型。高危型HPV包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82；可能的高危型包括HPV26、53和66；低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81和CP6108。HPV與多種疾病密切相關，低危型HPV能引起良性生殖器疣；而高危型HPV則可引起宮頸癌、外生殖器癌及高度子宮頸上皮內瘤等惡性病變。因此，HPV感染的檢測和分型對了解女性生殖道腫瘤相關病情、判斷預后、指導治療、分析HPV流行狀況以及基因疫苗的研制均具有重要價值。

由于HPV具有高度種屬特異性，難以在體外常規細胞培養系統中培養，也不能通過分離病毒來確定型別，目前缺少一種可行的血清學技術檢驗手段，因此，HPV的檢測只能依賴對其DNA序列的分子水平的檢查。

第二代雜交捕獲法(hybrid?caputure?II，HC-II)是經美國FDA認證的可應用于臨床的HPV?DNA檢測技術，HC-II采用孔平板法，可一次檢測13種高危型HPV病毒(包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、69)型，具體操作步驟：樣本DNA雙鏈被釋放并分解為核苷酸單鏈。DNA單鏈與RNA探針結合為RNA-DNA雜交體。特異性抗體將RNA-DNA雜交體固定在微孔壁上。結合有堿性磷酸酶的多個二抗與RNA-DNA雜交體結合，放大信號。堿性磷酸酶使酶底物發光，根據光的強弱確定堿性磷酸酶的含量，從而確定RNA-DNA雜交體的含量。檢測結果的判斷標準是RLU(相對光單位，光信號)/Cutoff(域值＝三個陽性質控指標的平均值)≥1為陽性，＜1為陰性。HC-II檢測靈敏度高、重復性好且客觀性強，然而缺點是無法明確宮頸病變中感染的HPV型別。