[發明專利]適于NSO細胞大規模培養及抗體生產的無蛋白培養基

有效

• 申請號: 200810039305.8
• 申請日: 2008-06-20
• 公開（公告）號: CN101418330A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發明（設計）人: 牛紅星;趙亮;范里;周燕;譚文松
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12P21/08
• 分類號: C12P21/08;C12N5/10
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所
• 代理人: 刁文魁;翟 羽

【技術領域】

本發明涉及現代生物技術之培養基研發技術領域，具體地說，是一種適 于NSO細胞大規模培養及抗體生產的無蛋白培養基。

【技術背景】

現代生物技術是21世紀重點發展的前沿技術之一。其中，利用動物細胞 培養技術生產具有重要醫用價值的生長因子、疫苗和單抗等已成為醫藥生物 高技術產業的重要組成部分。為完善動物細胞培養技術，人們非常關注對培 養動物細胞的培養基的研究，因為，培養基是動物細胞培養技術的基礎和關 鍵要素之一。在過去幾十年里，隨著科學技術的發展，動物細胞培養經歷了 采用有血清培養基、無血清培養基和無蛋白培養基的幾個階段。

動物細胞培養是生產基因工程產品中的重要環節，研究發現，采用含有 血清的細胞培養基會給生產及科研帶來許多不利因素：第一，影響細胞生長 及產品質量，存在批間差異；第二，易被支原體和病毒污染；第三，成分復 雜且不確定，給產物的分離純化帶來極大的困難；第四，血清的價格非常昂 貴，其費用通常占到培養基整體費用的50％以上，致使生產成本大幅度提高。 因此，血清在動物細胞大規模培養中的使用已受到了限制。

二十世紀50年代初，人們開始了對無血清培養基的研究；80年代后，無 血清培養基的研究取得了迅速的發展，多種能支持不同種類細胞生長的無血 清培養基見諸報端；80年代末90年代初，具有商業應用價值的無血清培養基 紛紛上市，其中有：

Darfler等人開發的CITTL無血清培養基〔以DMEM/F12(1∶1)為基礎培養 基，添加了5mg/L的過氧化氫酶、1.5mg/L的胰島素、1.5～3.0mg/L的轉鐵 蛋白、2nmol/L睪酮、0.5mg/L的二亞油酰磷脂膽堿和1.5mg/L的β-甘油磷 酸〕，該無血清培養基可支持s49細胞的生長，也可用于雜交瘤細胞的培養。 Chang等人(1980)用所報道的無血清培養基成功地培養了幾株雜交瘤細胞。

Murakami等人開發的無血清培養基〔以DMEM/F12(1∶1)為基礎，添加了 5mg/L胰島素、2～35mg/L轉鐵蛋白、20μmol/L乙醇胺和1nmol/L亞硒酸鈉等 物質〕，這就是現在被廣泛使用的DMEM/F12-ITES配方。

Kover和Frank開發的無血清培養基〔以RPMI?1640為基礎培養基，并添 加了10mg/L胰島素、5mg/L轉鐵蛋白、20μmol/L乙醇胺、5mg/L亞油酸、1g/L 牛血清蛋白、3mg/L抗壞血酸、2μg氫化可的松和12種微量元素〕，這一培養 基適合幾種細胞的生長。

但是，研究中發現，無血清培養基中添加的蛋白成分價格太貴，且有的 成分，如牛血清蛋白，含有很多種雜質，給后期的分離純化帶來較大困難， 而且目前的新藥審批對此方面的要求也越來越嚴格。因此，在商用無血清培 養基之后，科學家們又開始了對無蛋白培養基的研究，從動物細胞的培養基 中去掉蛋白成分。

在對細胞營養需求研究的基礎上，美國專利5,045,468公開了一種適合 雜交瘤細胞生長的無蛋白培養基，該培養基通過添加亞硝基鐵氰化物、EDTA、 二氧化硒或亞硒酸鈉等化合物有效取代了培養基中的蛋白成分。美國專利 5,804,420公開了一種適合BHK細胞表達重組因子VIII的無蛋白培養基，其 中添加了嵌段式聚醚F68(Pluronic?F-68)、硫酸銅、硫酸亞鐵、EDTA、錳、 鉬、硅、鋰、鉻等成分。另有報道，Jinyou?Zhang等人成功地開發了一種適 合NSO細胞生長的無蛋白培養基，但由于其成分復雜、還包含了一種價格昂 貴、且化學成分未明確的商業混合脂，因此，不適用NSO細胞的大規模培養 及抗體生產。??

目前，在無蛋白培養基技術領域，以Gibco、Hyclone、JRH等為代表的 商業無血清、無蛋白培養基已相繼問世，近年來眾多研究所報道的培養基大 多采用這些商業無蛋白培養基，它們對某些細胞株具有良好的效果；但是， 它們同樣也存在一些明顯的缺點，將其用于某些研究和大規模細胞培養與抗 體生產過程會有不少困難，其主要問題是：第一，價格昂貴，只適合一部分 實驗室小規模研究，不適合大規模細胞培養及抗體生產；第二，大多成分復 雜，并且添加了不確定的化學成分，給科研和生產過程帶來困難；第三，有 些培養基雖能很好地支持細胞生長，但卻使細胞表達產物的能力降低，甚至 喪失。

【發明內容】