[發明專利]一種采用核酸連接酶進行單核苷酸多態性檢測的方法及試劑盒

無效

• 申請號: 200810039223.3
• 申請日: 2008-06-19
• 公開（公告）號: CN101608214A
• 公開（公告）日: 2009-12-23
• 發明（設計）人: 樊春海;萬瑩;張炯;宋世平
• 申請（專利權）人: 蘇州市長三角系統生物交叉科學研究院有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/00
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司
• 代理人: 徐 迅

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用核酸連接酶結合電化學技術進行單核苷酸多態性(SNP)檢測的方法及試劑盒。

背景技術

單核苷酸多態性(SNP)是指基因組DNA中某一特定核苷酸位置上發生變化。SNP在基因組中分布相當廣泛，研究表明在人類基因組中大約每300bp就出現一次，而且任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1％，它意味著個人間最小的遺傳差異。SNP具有數量多、分布廣和穩定遺傳等特點，它與許多疾病直接相關，是決定人類疾病易感性和藥物反應差異的主要因素。因此SNP分析在新藥研究、個體化用藥、臨床檢驗和分子診斷等領域內存在巨大的產業價值，并受到廣泛的關注。隨著對SNP研究的廣泛關注，檢測技術得到了快速的發展，出現了許多SNP檢測技術。

SNP分析技術按其研究對象主要分為兩大類，即：①對未知SNP進行分析，即找尋未知的SNP或確定某一未知SNP與某遺傳病的關系。檢測未知SNP有許多種方法可以使用，如溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、單鏈構象多態性(SSCP)、變性的高效液相色譜檢測(DHPLC)、限制性片段長度多態性(RFL?P)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)等，但這些方法只能發現含有SNP的DNA鏈，不能確知突變的位置和堿基類別，要想做到這一點，必須對那些含有SNP的DNA鏈進行測序。②對已知SNP進行分析，即對不同群體SNP遺傳多樣性檢測或在臨床上對已知致病基因的遺傳病進行基因診斷。對已知SNP檢測的方法主要基于以下4種基本原理：等位基因特異性雜交、內切酶酶切技術、引物延伸法、寡核苷酸連接反應。

SNP研究現在正處于發展之中，雖然它有很好的前景，但目前仍存在不少問題。其主要原因在于目前雖然有大量檢測SNP的方法，但大都價格昂貴，速度較慢，這限制了其在實際中的應用，所以目前迫切需要開發低成本，高生產率的新檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測待測核酸第x位堿基的單核苷酸多態性(SNP)的方法。

本發明的另一目的在于提供一種檢測待測核酸第x位堿基的單核苷酸多態性的芯片以及試劑盒。

在本發明的第一方面，提供一種檢測待測核酸第x位堿基的單核苷酸多態性(SNP)的方法，所述方法包括：

(a)提供一種芯片，所述的芯片包括：基片，所述的基片表面是一金屬基面，其上具有區域1，區域2，區域3，和/或區域4，其中，

區域1固定有游離端末端堿基是A的捕獲探針，

區域2固定有游離端末端堿基是T的捕獲探針，

區域3固定有游離端末端堿基是C的捕獲探針，

區域4固定有游離端末端堿基是G的捕獲探針，

其中，當所述捕獲探針的游離端為3端時，與所述末端堿基相鄰的5-100bp(較佳的10-100bp；更佳的15-30bp)堿基與所述待測核酸第x位堿基之后且與該第x位堿基相鄰的5-100bp堿基特異性互補；當所述捕獲探針的游離端為5端時，與所述末端堿基相鄰的5-100bp(較佳的10-100bp；更佳的15-30bp)堿基與所述待測核酸第x位堿基之前且與該第x位堿基相鄰的5-100bp堿基特異性互補；

(b)將待測核酸、信號探針和核酸連接酶加樣于所述芯片的區域1，區域2，區域3和區域4，進行連接反應；

其中，當所述捕獲探針的游離端為3端時，所述信號探針的序列自5端起的5-100bp(較佳的10-100bp；更佳的15-30bp)堿基與待測核酸第x位堿基之前且與該第x位堿基相鄰的5-100bp(較佳的10-100bp；更佳的15-30bp)堿基特異性互補，且所述的信號探針的3末端連接有電流反應檢測信號；當所述捕獲探針的游離端為5端時，所述信號探針的序列自3端起的5-100bp(較佳的10-100bp；更佳的15-30bp)堿基與待測核酸第x位堿基之后且與該第x位堿基相鄰的5-100bp(較佳的10-100bp；更佳的15-30bp)堿基特異性互補，且所述的信號探針的5末端連接有電流反應檢測信號；

(c)對(b)的芯片上的核酸進行變性處理，去除非固定于基片的核酸鏈和未反應的信號探針；

(d)電化學法檢測(c)獲得的芯片上區域1，區域2，區域3，和/或區域4的電流反應檢測信號，

若電流反應檢測信號位于區域1，則待測核酸第x位堿基是T；

若電流反應檢測信號位于區域2，則待測核酸第x位堿基是A；

若電流反應檢測信號位于區域3，則待測核酸第x位堿基是G；