[發(fā)明專利]光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810036596.5
• 申請日: 2008-04-24
• 公開（公告）號: CN101281137A
• 公開（公告）日: 2008-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王海蛟;趙衛(wèi)國
• 申請（專利權(quán)）人: 博陽生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N21/63;G01N33/53
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)。

背景技術(shù)

光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)是一種以高分子微粒為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光技術(shù)，它可以通過感光微粒和發(fā)光微粒在一定距離范圍內(nèi)結(jié)合，產(chǎn)生離子氧能量傳遞，發(fā)出光信號，從而對待測樣品進(jìn)行檢測。感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒，發(fā)光微粒是填充有發(fā)光化合物和鑭系元素的高分子微粒。光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)的核心原理是能量的近距離轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的介質(zhì)是高能態(tài)的離子氧。當(dāng)紅色激光照射感光微粒后，釋放單線態(tài)氧離子(4μs)，其傳播距離為200nm左右，只有當(dāng)感光微粒和發(fā)光微粒的距離足夠接近的情況下，感光微粒釋放的單線態(tài)氧離子才能到達(dá)發(fā)光微粒，從而產(chǎn)生一系列化學(xué)反應(yīng)，發(fā)射出520～620nm高能級的光，由于反應(yīng)體系中，微粒的濃度很低，碰撞幾率非常小，因此本底信號微弱，只有感光微粒和發(fā)光微粒通過免疫反應(yīng)結(jié)合以后，才會發(fā)射出明顯的光，因此系統(tǒng)靈敏度很高。相對于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法，它具有均相(免沖洗)、靈敏度高和操作簡便等特點(diǎn)，并且易于實(shí)現(xiàn)自動化，因此其應(yīng)用前景十分廣闊。

本發(fā)明正是針對以上技術(shù)原理進(jìn)行了深入的研究，開發(fā)出了以上技術(shù)原理的應(yīng)用條件，確定了激發(fā)光最優(yōu)化激發(fā)功率及波長，發(fā)射光光源的最優(yōu)化檢測波長，發(fā)射光最優(yōu)化檢測延遲時間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，從多方面對其檢測條件進(jìn)行優(yōu)化。

本發(fā)明公開了一種光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，包括下列步驟：

a.以620-700nm的激發(fā)光照射含有發(fā)光微粒及感光微粒的反應(yīng)溶液；

b.檢測反應(yīng)溶液的發(fā)射光量，發(fā)射光的檢測波長為450-650nm。

上述步驟a以激發(fā)光照射反應(yīng)溶液到步驟b檢測反應(yīng)溶液發(fā)光量之間有一檢測延遲時間，其范圍為10ms-1000ms。

上述步驟a以激發(fā)光照射反應(yīng)溶液的時間為50ms-2000ms；優(yōu)選200ms-1800ms，激發(fā)最佳為500-1000ms。

較佳的，上述激發(fā)光的波長范圍為640-680nm，優(yōu)選660nm，發(fā)射光的檢測波長范圍為610-620nm，優(yōu)選615nm。

較佳的，激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw，優(yōu)選40-60mw。

上述發(fā)光微粒及感光微粒包被有抗原或抗體。

上述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)₃/TOPO或Eu(TTA)₃/Phen等，該微粒可由市場上購得。發(fā)光微粒的表面官能團(tuán)可以是任何能聯(lián)接蛋白質(zhì)的基團(tuán)，如羧基，醛基，胺基，環(huán)氧乙基或鹵代烷基等各種已知的可連接蛋白質(zhì)的官能團(tuán)。

上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒，在紅色激光激發(fā)下，可以產(chǎn)生單線態(tài)氧離子。當(dāng)其與發(fā)光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發(fā)光微粒，與發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物反應(yīng)，產(chǎn)生紫外光，紫外光再進(jìn)一步激發(fā)鑭系元素化合物，產(chǎn)生一定波長的光子。感光化合物可以是酞菁染料等，該微粒也可由市場上購得。

上述反應(yīng)溶液的溶劑可以是常規(guī)的適合抗原抗體反應(yīng)的溶劑體系，如HEPES緩沖體系或Tris緩沖體系。溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護(hù)作用的物質(zhì)如BSA以及防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑如Tween20，出于對試劑防腐以及長期儲存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，如慶大霉素和Proclin?300。

本發(fā)明的關(guān)鍵在于，經(jīng)過研究光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法中激發(fā)光、發(fā)射光、檢測時間等選擇條件，給出了相應(yīng)參數(shù)合適檢測的選擇范圍，及優(yōu)選的參數(shù)范圍，從而使得光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法的可控性更強(qiáng)，靈敏度及精確度得到進(jìn)一步地提高。

上述光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法可以有多種應(yīng)用，如用于生物活性物質(zhì)的定性或定量檢測。在生物活性物質(zhì)定性或定量檢測中，可采用雙抗體夾心法。即可將發(fā)光微粒包被抗原或抗體，而后將待測抗體或抗原，與標(biāo)記蛋白(如生物素)標(biāo)記的抗原或抗體一起進(jìn)行孵育反應(yīng)，再與包被有抗標(biāo)記物(如親和素)的感光微?；旌戏跤@得反應(yīng)液，所謂抗標(biāo)記蛋白即為可與標(biāo)記蛋白特異性結(jié)合的蛋白，而后采用前述條件進(jìn)行激發(fā)光照射并檢測發(fā)射光量，從而達(dá)到定性或定量檢測目的。反之亦可，即將感光微粒包被抗原或抗體，而后待測抗體或抗原，與標(biāo)記蛋白標(biāo)記的抗原或抗體一起進(jìn)行孵育反應(yīng)，再與包被有抗標(biāo)記蛋白的發(fā)光微粒混合孵育，而后采用前述條件進(jìn)行激發(fā)光照射并檢測發(fā)射光量。