[發明專利]分離與純化單個病毒的方法

無效

• 申請號: 200810036428.6
• 申請日: 2008-04-22
• 公開（公告）號: CN101565691A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 呂軍鴻;王鵬;胡鈞
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海應用物理研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 鄧 琪

技術領域

本發明涉及一種病毒的分離與純化方法，特別是一種基于原子力顯微鏡納米操縱技術分離單個病毒的方法。

背景技術

對生物分子的分離分析一直是生物學研究的關鍵技術和重要內容。生命科學和生物技術的迅猛發展迫切需要在更加微觀的尺度上(單細胞或單分子水平)將其分離進而獲取相關生物化學信息的手段和工具(大學化學，2004，19：10-15)。近十年來，先后涌現出了各式各樣可以分離微量甚至單個特定生物體的技術(分析試驗室，2002，21：97-104)，主要包括流式細胞術(Cytometry，2000，42：284-289)、激光捕獲顯微分離(Science，1996，274：998-1001)、毛細管電泳(Journal?of?Chromatography?B，1999，722：141-151)、雙向電泳(Trends?Food.Sci.Technol.，1995，6：51-58)、光鑷(Trends?Food.Sci.Technol，1995，6：51-58)、磁鑷(Nature?ReviewsMolecular?Cell?Biology，2000，1：130-136)、微流控芯片(Applied?PhysicsLetters，2004，84：1786-1788)。由于技術局限，目前這些手段大多還處于分離單個細胞或者痕量分子，其分辨率也只有微米尺度，但對單個病毒和單個病毒的分離仍然是比較困難的，并且不能夠定位分離。

原子力顯微鏡(atomic?force?microscopy，AFM)不僅是一種具有納米分辨率的成像手段，而且也是一種可以進行納米定位操縱的工具(Micron，2002，33：385-397)。人們先后嘗試了用AFM探針分離微量甚至單個生物分子。如Heckl教授領導的研究小組于1997年率先實現了對染色體的特定區域的精確分離(J?Struct.Biol.，1997，119：232-237)，但獲得的物質是包括蛋白質與核酸等在內的混合物，無法每次都獲得完全一致的樣品；后來，Oesterhalt等用AFM針尖從嗜鹽菌紫膜上分離出了單個蛋白質分子(Science，2000，286：143-146)，但問題在于事先要特定的抗體對針尖做修飾，其重復性也存在問題；2003年Osada等將AFM針尖插入到細胞內部分離mRNA，從而研究了基因在細胞內的表達情況，但這只能夠通過隨機黏附的方式來實現，無法準確定位，更不能保證每次分離的數量(Journal?of?Nanobiotechnology，2003，1：2)。Lu等用AFM針尖成功地實現了對單個DNA分子的定位切割和分離(J.Am.Chem.Soc.，2004，126：11136-11137)，但由于病毒大多為蛋白質外殼包被的顆粒，直徑在幾十納米到幾百納米大小，要比蛋白質和DNA大很多，且十分易碎，但目前還沒有用AFM來分離單個病毒的報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題就是克服上述已有技術的局限，提供一種可對單個病毒分離與純化的方法。

本發明所提供的一種單個病毒的分離方法概括地說就是采用納米操縱技術分離單個病毒的方法。具體地說，該方法包括下列步驟：

(1)將病毒樣品放置于平整的基底表面；

(2)利用可成像的分離裝置對病毒樣品進行成像，并獲取其物理性質；

(3)根據物理性質不同選定單個病毒；

(4)用分離裝置探針針尖在含有單個病毒的區域內掃描，當針尖掃描到病毒附近時，根據所要分離的病毒的物理性質，降低針尖到一定高度，使針尖與病毒接觸并將病毒黏附在針尖上，從而實現單個病毒的分離。

所說的基底，最好是原子級平整的基底，可以是云母，也可以是硅，也可以是玻璃、也可以是石墨，還可以是化學修飾后的基底。

所說的病毒樣品可以是經純化或不純化的病毒溶液，也可以是含有病毒的組織或細胞切片。

所說的單個病毒可以是病毒顆粒，也可以是裸露病毒。

所說的根據物理性質不同選定單個病毒，是根據病毒的形貌、大小、彈性選擇。

所述使針尖與病毒接觸并將病毒黏附在針尖上的步驟是通過推的納米操縱，改變探針針尖的降低的高度來調節針尖與病毒之間的作用力而實現。

所說的分離單個病毒，可以是一次只分離一個病毒，也可以是連續分離單個病毒。

所述分離裝置為原子力顯微鏡或基于原子力顯微鏡原理的裝置。

所說的分離裝置的探針可以經過修飾或不經修飾。