[發明專利]丹參3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A合成酶基因及其編碼的蛋白質和應用

無效

• 申請號: 200810035719.3
• 申請日: 2008-04-08
• 公開（公告）號: CN101250542A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: 開國銀;王敬;陸楊;董彥君;周根余
• 申請（專利權）人: 上海師范大學
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/63;C12N9/00;C12N5/10;C12N1/21;C12N1/19;A01H1/00;C12R1/19;C12R1/645
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司
• 代理人: 吳瑾瑜

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體說，是涉及在丹參中表達的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因及其編碼的蛋白質和應用。

背景技術

丹參酮(tanshinone)是一種從中國傳統的中藥材丹參中分離得到的一類活性物質，主要由脂溶性的丹參酮I、丹參酮IIA、二氫丹參酮、隱丹參酮等丹參酮類組成。醫學臨床大量應用總丹參酮治療金黃色葡萄球菌及其耐藥菌株、鏈球菌等引起的化膿性扁桃腺炎、乳腺炎、蜂窩組織炎、骨髓炎、外耳道炎癥及癰腫，外科感染等療效顯著。丹參酮廣泛應用于臨床醫學，目前全球市場需求十分巨大。現代工業化生產中的丹參酮主要靠從丹參等天然植株中提取而獲得。然而丹參酮的提取工藝繁瑣，損耗量大，且丹參酮及其類似物在植物體內含量較低，所以從天然的丹參中提取丹參酮的方法遠遠不能滿足人們對丹參酮日益增長的需要。因此，丹參酮藥源的嚴重匱乏，已經成為制約丹參酮相關產業發展的最大障礙。

近年來植物基因工程技術的飛速發展和廣泛應用，為利用現代生物技術提高丹參酮或其前體的含量開辟了一條嶄新的途徑。利用現代生物技術將丹參酮生物合成途徑中的關鍵酶基因導入丹參中，獲得轉基因的細胞系、組織或再生植株，并進行大規模的培養，是實現從根本上提高丹參酮含量的最佳途徑。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶是MVA途徑中的一個重要的代謝酶，能夠催化乙酰輔酶A和乙酰乙酰輔酶A縮合生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A，隨后在HMG-CoA還原酶(HMGR)的作用下生成甲羥戊酸(MVA)，甲羥戊酸經焦磷酸化和脫羧作用形成C5的IPP，從而為丹參酮合成提供通用前體。通過提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶的活性或含量，可以間接的提高丹參中丹參酮或其前體的含量。

藥用植物丹參(Salvia?miltiorrhiza?Bunge)為唇形科多年生草本植物，主主產四川、山東、浙江等省。在我國民間常用于祛瘀止痛，活血通經，清心除煩。現代醫學研究證明，丹參所含的活性成分具有擴張血管、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抑制血小板凝聚、保護心肌、抗菌消炎及抗腫瘤等作用。由于丹參作為重要的產丹參酮的草本植物，使其具有更多的研究優勢如生長快周期短，易于遺傳轉化及植株再生等，這無疑為研究丹參酮的生物合成及其分子調控提供了更加快捷的來源與途徑。

在對現有文獻的分析中，“Scinece?Asia(亞洲科學)2002，28：29-36”報道了從橡膠樹中克隆了3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因，但至今尚未有從藥物植物丹參中分離克隆出3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因的文獻報道。由于這個基因編碼的酶對于丹參酮的生物合成具有重要影響，因此，這一步是利用基因工程技術來調控丹參酮生物合成的重要切入點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種丹參3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因。

本發明第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質。

本發明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細胞。

本發明的另一個目的在于提供該基因及其編碼的蛋白質的應用。

本發明所提供的丹參3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因(DsHMGS)為以下核苷酸序列之一：

(1)具有SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。

該基因所編碼的蛋白質為丹參3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶，是以下氨基酸序列之一：

(1)具有SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ?ID?No.2添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。

含有本發明的丹參3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因全序列或部分片段的重組載體，均屬于本發明的保護范圍。這些重組載體包括質粒和植物表達載體。

含有本發明的丹參3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶基因的宿主細胞，如含有上述重組載體的宿主細胞也屬于本發明的保護范圍。

宿主細胞選自大腸桿菌細胞、農桿菌細胞、酵母細胞、煙草細胞、丹參細胞或丹參發根細胞。

優選的宿主細胞為大腸桿菌細胞或農桿菌細胞或丹參發根細胞。