[發明專利]一種缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素的表達方法及應用

無效

• 申請號: 200810035198.1
• 申請日: 2008-03-26
• 公開（公告）號: CN101440369A
• 公開（公告）日: 2009-05-27
• 發明（設計）人: 李靜;顧娟;黃靜;吳自榮;吳葉林;馬驍駿;張緒英
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/28;C07K19/00;A61P3/10;A61P7/00
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司
• 代理人: 程宗德

技術領域

本發明涉及一種缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素的表達方法和應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

隨著生物技術的日益發展，越來越多的具有生理活性的多肽或蛋白質分子被發現，多肽和蛋白類藥物在現代疾病預防和治療中作用日益突出。至今，美國已經開發生物多肽藥物300多個。但是，由于多肽分子難以透過生物膜，加之體內外穩定性差、體內生物利用度低，一般只能注射給藥。口服劑型易被患者接受，是多肽藥物非注射劑型的主要發展方向。相對于注射給藥，口服是一種方便并且病人依從性比較高的給藥方式，對于需要長期給藥的病人尤其方便。蛋白多肽類藥物目前已有個別品種實現了口服給藥，如口服干擾素、胸腺肽、腦蛋白水解物等。但是，由于藥物本身的結構以及人體的吸收問題，蛋白多肽類藥物口服生物利用度很低。通常情況下，蛋白多肽類藥物分子量大，難以通過消化系統的生物膜屏障；胃酸、消化道酶等對蛋白多肽類藥物有破壞、降解或聚合作用，嚴重影響其穩定性。因此，提高口服生物利用度是蛋白多肽類藥物口服給藥的關鍵。近年來，蛋白多肽類藥物的口服給藥技術研究不斷取得新進展，為進一步發揮其功效提供了新的技術支撐。

霍亂弧菌封閉帶毒素Zonula?Occludens?Toxin，簡稱ZOT，是美國科學家Fasano等1991年采用Ussing?Chambers分析法測定CT陰性和CT陽性霍亂弧菌培養物上清液時發現的、由399個氨基酸組成的一種毒素。它通過影響細胞間緊密連接(tight?junction，或稱封閉帶)，增加小腸粘膜的通透性。ZOT能可逆地調節緊密連接的結構，因而它能影響生物大分子物質的吸收。但是封閉帶毒素為大分子，易形成包涵體，難以通過基因工程技術獲得可溶性蛋白，為研究其生物學功能增加了難度。缺失的霍亂弧菌封閉帶毒素(deletion?Zonula?OccludensToxin，cZOT)，是Marinarosaria等通過缺失ZOT基因不同區域，分析發現的封閉帶毒素活性中心，是封閉帶毒素的265～399位氨基酸片斷，具有封閉帶毒素的完整生物學功能，能夠改變上皮細胞的通透性，促進蛋白、激素等大分子藥物由黏膜吸收，增強可溶性蛋白的生物學活性，而且這一作用可逆、安全，不損傷組織，從而可能成為一種新穎、安全的多肽口服佐劑。由于其獨特的生物學性質，使用cZOT有可能開辟一種新穎的生物大分子藥物口服給藥新途徑，給制藥工業及疫苗工業展示了光明的前景.

但是，cZOT有135個氨基酸，分子量大，目前技術條件下無法通過化學合成的方法獲得；即使能夠化學合成，其合成成本高，純化困難。因此，需要一種高效廉價的基因工程制備cZOT的方法。同時，由于該基因稀有密碼子含量較高(占30％)，而常規的大腸桿菌BL21(DE3)不提供稀有密碼子的翻譯，所以cZOT在BL21(DE3)中表達含量較低。因此，我們利用Rosetta?gami(DE3)對稀有密碼子的偏愛性，選擇大腸桿菌Rosetta?gami(DE3)進行誘導表達，以提高cZOT的表達量。

發明內容

本發明的目的是提供一種cZOT的高效表達方法，以期利用該方法大規模低成本地發酵生產cZOT。

本發明要解決的一個技術問題是提出一種高效表達cZOT的基因工程菌。該基因工程菌是攜帶重組質粒的大腸桿菌Rosetta?gami(DE3)，所述重組質粒是含cZOT基因的質粒pET-32a(+)。具體分以下幾個步驟：

1.構建含cZOT基因的大腸桿菌(E.coli)基因工程菌

將cZOT基因按照：SD序列-純化標簽His·Tag-硫氧還蛋白(Trx)-蛋白酶(腸激酶EK)酶切位點-cZOT基因-終止密碼子(TAA)的堿基序列設計上游引物和下游引物，PCR得到該片斷；用兩種限制性內切酶Kpn?I和EcoR?I雙酶切該片斷，得到cZOT基因；用同樣兩種限制性內切酶雙酶切質粒pET-32a(+)，純化回收大片段，連接上述兩種基因片段，得到重組質粒pET-32a(+)-cZOT；

2.構建高效表達cZOT的基因工程菌

將重組質粒pET-32a(+)-cZOT轉化到大腸桿菌Rosetta?gami(DE3)感受態細胞中，在含有氨芐青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)、四環素(12.5μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)中任意1-4種抗生素的LB固體培養基上培養16-20h，挑取陽性轉化子，經測序驗證，獲得高效表達cZOT的基因工程菌；

3.制備獲得TrxA-cZOT融合蛋白