[發明專利]一種微量DNA的多重PCR檢測方法

無效

• 申請號: 200810035152.X
• 申請日: 2008-03-25
• 公開（公告）號: CN101245389A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發明（設計）人: 王劍暉;于明輝;李凱;陸炯;肖君華
• 申請（專利權）人: 東華大學;上海翼和應用生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術領域

本發明屬核酸檢測領域，特別是涉及一種通過改變引物濃度和引物添加方式的多重PCR技術實現對微量DNA的超靈敏檢測。

背景技術

聚合酶鏈式反應(PCR)是現今生物檢測中最常用的擴增技術，它能將某一DNA片段在幾個小時內擴增幾十萬至百萬倍。并且隨著熒光定量PCR的普及和應用，目標序列的定量也能準確的完成。但是一般PCR僅應用一對引物，通量低，而且對起始模板濃度有要求，靈敏度低。但對于很多研究來說，起始樣本的DNA非常有限，尤其是一些很珍貴的臨床樣本，比如受精卵，激光捕獲顯微切割獲得的細胞等。因此，建立一種通量高、靈敏度高的方法用于分析少量細胞DNA顯得十分迫切和必要。

多重PCR(multiplex?PCR)是在普通PCR的基礎上加以改進，于一個PCR反應體系中加入多對特異性的引物，針對多個DNA模板或者同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR技術。這一概念由Charnberian等【Nucleic?Acids?Res.1988，16：11141-11156】率先于1988年提出。由于多重PCR同時擴增多個目的基因，具有節省時間、降低成本、提高效率的優點，特別是節省珍貴的實驗樣本，所以一經提出，即得到眾多研究者的青睞，并且發展迅速，在生命科學的各個領域，多重PCR已經成為一項成熟而重要的研究手段。

由于多重PCR要求在同一反應體系中進行多個位點的特異性擴增，因而技術難度增大。一個理想的多重PCR反應體系，并非單一PCR的簡單混合，需要針對目標產物，進行全面分析、反復實驗，建立適宜的反應體系和反應條件。大量的實驗表明，多重PCR的主要技術問題在于引物的設計，組合和濃度優化。目前的研究在對多重PCR的引物優化主要從兩個方面進行：一方面是對引物的設計進行序列間的比對，減少引物之間的互補和配對幾率；另一方面是在實驗中對各位點引物的濃度條件進行摸索，調整各組引物的相對濃度，以達到各位點平衡而高效的擴增。這樣的優化對于正常的多重PCR反應效果很好，但是對于微量DNA的多重PCR效果不明顯，因為在正常的多重PCR反應中，由于模板分子數比較多，引物和模板之間的相互作用比較容易進行；但是，當模板的濃度過低，比如低于100個分子時，由于分子之間的相互作用減少，引物和模板之間就很難發生退火反應，而另一方面，由于引物很多，濃度很高，分子數大大過量，引物自身進行反應形成二聚體的幾率就大大增加，其結果就導致體系中各組分在形成二聚體的過程中大量消耗，而無法完成目的產物的擴增。

1989年發展出了一種Booster?PCR的方法【Nucleic?Acids?Res，1989，17：5407】，可以解決低模板量下的PCR擴增問題。其原理是在低模板分子數的情況下，同時降低引物的濃度，使得引物和模板之間的作用，與引物和引物之間的作用的相對比例增加，使反應向目的片段的擴增方向進行。具體操作為：開始幾個循環中保持引物的低濃度，以確保開始擴增的準確性。在目的片段的數量有了一定的增加以后，然后在后面的循環中，將引物的濃度提高，保證擴增的效率。整個操作簡單易行，可以有效地對微量模板DNA進行檢測，但是此方法僅限于單一位點分析，無法進行多位點分析。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種微量DNA的多重PCR檢測方法，是一種超靈敏的多重PCR方法來檢測微量DNA，該方法通過改變多重PCR反應中引物濃度和引物添加方式來解決低模板量下的PCR擴增問題。整個方法操作過程簡單，不需要專業人員，特異性高，并且靈敏度與PCR效率都很高，在實際應用中有廣泛的應用前景。

本發明的一種微量DNA的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：

(1)待檢樣本DNA的抽提；

(2)以上面抽提得到的DNA為模板，選取引物1進行PCR反應；

(3)反應進行至15個循環的時候，將含有另外引物2的工作液補加到反應體系中，繼續進行未完成的反應；

(4)將PCR反應產物進行巢式PCR，分析結果。

所述DNA的抽提可以采用常規酚-氯仿抽提法，或用試劑盒抽提。

所述的步驟(2)中選取的引物1至少為一對。

所述的步驟(3)中補加的引物2至少為一對。

所述的步驟(2)與(3)所加的引物區別在于擴增的目的片段不同，步驟(3)所加的引物是用于對步驟(2)沒有擴增的基因進行擴增。

本發明為了避免引物過多造成的競爭抑制問題，采用低引物濃度和引物“補加”方式來進行多重PCR反應。

本發明的有益效果：