[發(fā)明專利]實驗室貼壁細(xì)胞薄膜培養(yǎng)裝置及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810034532.1
• 申請日: 2008-03-13
• 公開（公告）號: CN101245315A
• 公開（公告）日: 2008-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊柳;齊念民;孫海英;胡詩宇
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12M3/04
• 分類號: C12M3/04;C12M1/22;C12N5/00
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的裝置及方法，具體是一種實驗室貼壁細(xì)胞薄膜培養(yǎng)裝置及方法。

背景技術(shù)

實驗室常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)傳代方法，大致如下，以65mm平皿接種Vero細(xì)胞系為例，將接種的少量細(xì)胞懸液加入約2ml的培養(yǎng)液，輕輕搖勻后置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到一定密度時進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞傳代時首先吸棄培養(yǎng)基，用1-2ml的PBS沖洗2遍，加入胰酶或膠原酶1ml，置于培養(yǎng)箱中溫孵5-10min后加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕反復(fù)吹打，直至平板上的細(xì)胞完全脫落，平板底部變得光滑透亮，用移液管吸取細(xì)胞懸液按比例分置在下一代平皿中，加入一定量的培養(yǎng)基輕輕平搖混勻，重復(fù)以上操作。

從以上步驟可以看出，對于嚴(yán)格要求染菌幾率低、下一代平行培養(yǎng)以及批量傳代的實驗來說，仍然存在諸多弊端：(1)對細(xì)胞消化過程中吹打操作有一定技術(shù)要求，容易造成后期的實驗誤差不易預(yù)計。(2)對平皿不同位置的吹打效率不一樣，造成的傳代結(jié)果與細(xì)胞當(dāng)初接種時未均勻平鋪開造成的差異相關(guān)，并可能因隨機(jī)吹打的重點不一，使得細(xì)胞不能均勻脫落。(3)由于貼壁不良的細(xì)胞最先被吹打下來，而越先吹打下來的細(xì)胞被用來撞擊其他細(xì)胞的頻率越高，受到的損傷和后期死亡率也越高，相應(yīng)通過槍口更加容易，被保留傳代的幾率也越高，通過時間積累效應(yīng)，選擇下來的是非均一，損傷率高、貼壁不良的細(xì)胞。(4)當(dāng)存在較大濃度差時，細(xì)胞擴(kuò)散更容易進(jìn)行，而反復(fù)吹打一般是采用高濃度的細(xì)胞懸液，對細(xì)胞的傷害較大，如果每吹打一次后就轉(zhuǎn)移懸液，然后吸取新鮮培養(yǎng)基，則成本增加了許多倍，要耗費(fèi)多倍的無菌移液管，并且染菌的機(jī)會和污染純凈培養(yǎng)基的機(jī)會倍增。(5)操作雖然在無菌超凈臺中進(jìn)行，但傳統(tǒng)吹打傳代的方式造成細(xì)胞暴露的時間較長，尤其是貼壁良好的細(xì)胞，有時每平方厘米需要十次左右的吹打才能沖洗到平皿平滑潔凈、細(xì)胞完全脫落的效果，因此需要有效的方法減少細(xì)胞的暴露，增加培養(yǎng)傳代過程的安全性。(6)后代細(xì)胞如要準(zhǔn)確定量，需獲得平行一代的最真實準(zhǔn)確細(xì)胞密度。目前缺少環(huán)節(jié)最少且最直接的計量方法。(7)如是玻璃平皿，清洗工作稍有難度。因此，利用薄膜代替平板作為細(xì)胞接觸面，將可能克服目前細(xì)胞培養(yǎng)及傳代過程的上述弊端。

經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，張宇等人在《中國組織工程研究與臨床康復(fù)》雜志2007-05-06發(fā)表的《殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜的制備及其與肌成纖維細(xì)胞的相容性》有相關(guān)提及，但并沒有系統(tǒng)地將薄膜培養(yǎng)提出作為實驗室一種新的適合常用的細(xì)胞培養(yǎng)裝置或方法，另外如《湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》中趙迪誠等人的《Separation?of?adhering?cell?colonies?with?a?direct?digestion?method》一文中，將細(xì)胞接種在血纖維蛋白膜上，這種思想及其益處(便于直接消化有效獲得單細(xì)胞克隆)與本發(fā)明十分吻合，但材料不利于普及和生產(chǎn)，不能作為一種常規(guī)的新型裝置被應(yīng)用于實驗室。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種實驗室貼壁細(xì)胞薄膜培養(yǎng)裝置及方法，使細(xì)胞傳代分取過程不但難度減少、操作安全方便、染菌機(jī)會降低，并使得平板培養(yǎng)的可變性、適應(yīng)性大大提高。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明所涉及的實驗室貼壁細(xì)胞薄膜培養(yǎng)裝置，包括平皿、有機(jī)聚合物薄膜層、粘附液層。有機(jī)聚合物薄膜層通過粘附液層貼在平皿內(nèi)底面。

所述有機(jī)聚合物薄膜層可根據(jù)需要選用聚酯類、聚氨基酸類(如聚天冬氨酸、聚氨酯)、殼聚糖與纖維素聚合物、離子聚合物等材料。

所述粘附液層，可根據(jù)薄膜材料選用甘油、丙二醇、含明膠的PBS緩沖液等。

本發(fā)明所涉及的實驗室貼壁細(xì)胞薄膜培養(yǎng)方法，本發(fā)明利用多種可適應(yīng)性的有機(jī)聚合物薄膜，在粘附液的作用下貼在平皿內(nèi)底面，在培養(yǎng)時供細(xì)胞附著并在需要的條件下整合適應(yīng)生長環(huán)境變化的抑制因素；在消化傳代時直接投入到準(zhǔn)確定量的培養(yǎng)液中，在封閉條件下利用人手或者高速搖床的力量洗脫細(xì)胞，然后直接從大瓶細(xì)胞懸液中取樣計數(shù)并直接分裝接種，所計數(shù)目即是所有下代平皿接種細(xì)胞密度，無需稀釋。

本發(fā)明包括以下步驟：

第一步，按照指定平皿規(guī)格，制備并剪取或購買已生產(chǎn)的有機(jī)聚合物薄膜，用一滴粘附液滴在平皿底面，輕晃均勻，貼上有機(jī)聚合物薄膜，并可用無菌三角玻棒輕輕涂勻，保證緊密貼合無氣泡。

第二步，按照傳統(tǒng)方法接種培養(yǎng)。