[發明專利]一種檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 200810033501.4
• 申請日: 2008-02-03
• 公開（公告）號: CN101226195A
• 公開（公告）日: 2008-07-23
• 發明（設計）人: 盧仁泉;郭林
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬腫瘤醫院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/573
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司
• 代理人: 包兆宜

1.一種檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，包括底板(1)、有色微粒結合物墊(3)、測試樣品墊(4)、吸水墊(5)和用于反應的微孔濾膜(2)；其特征是所述的有色微粒結合物墊上固定有有色微粒標記的抗人腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體，所述的微孔濾膜上設測定區(a)和參比區(b)，所述的測定區包被有抗人腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體，參比區包被抗鼠IgG或腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原液；所述的測定區和參比區的間距為5mm，參比區加樣位置為距吸水墊3mm處。

2.按權利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，其特征是所述的測定區包被的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體濃度為2.0～2.5mg/ml，所述的參比區包被的抗鼠IgG或抗原液與測定區的抗體濃度匹配，分別為1.5mg/ml或1.0mg/ml。

3.按權利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，其特征是所述的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。

4.按權利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，其特征是所述的有色微粒選自膠體金、膠體硒或彩色膠乳。

5.按權利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒，其特征是所述的反應的微孔濾膜選自硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、硝酸/醋酸纖維素混合膜、聚酯膜或尼龍膜。

6.權利要求1所述的檢測腫瘤型M2丙酮酸激酶的試劑盒的制備方法，其特征是通過下述步驟：

①提取腫瘤型M2丙酮酸激酶：

用鹽析法和層析法提取離體肝癌組織的腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原并進行活化；

②制備及純化抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體：

所得的抗原制備抗腫瘤型M2丙酮酸激酶的抗體并進行純化，

所述的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體；

③制備有色微粒；

④有色微粒標記抗體：

調整獲得的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體pH值至中性，標記有色微粒于該抗體；

⑤微孔濾膜的抗體包被和結合物墊上有色微粒結合物的固定：

在微孔濾膜上包被抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體和抗鼠IgG或抗原液；在結合物墊上進行有色微粒標記的抗腫瘤型M2丙酮酸激酶抗體固化干燥；

⑥制備免疫層析試劑盒。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是所述的步驟①的鹽析法為分段鹽析，用45-75％的硫酸銨分別沉淀，獲得粗提物；磷酸纖維素柱層析進一步純化，用含0.5mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸的洗脫緩沖液解離，濃縮后用pH7.2?PBS透析活化，冷凍干燥成凍干粉-20℃保存。

8.據權利要求6所述的制備方法，其特征是，所述的步驟②的單克隆抗體通過下述方法制備：用獲得的腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原用雜交瘤技術進行細胞融合、間接ELISA法篩選陽性孔、克隆培養獲得單抗；多克隆抗體通過下述方法制備：用獲得的腫瘤型M2丙酮酸激酶抗原與福氏佐劑混勻，通過實驗動物，獲得含多克隆抗體的抗血清后，用辛酸法和/或飽和硫酸銨純化。

9.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是，其中步驟③的有色微粒通過下述方法制備：在100ml蒸餾水中加入1ml?1％氯金酸V/V，加熱至沸騰，加入1％檸檬酸三鈉溶液1ml，煮沸10分鐘，冷卻后得膠體金，4℃保存；在4℃269ml蒸餾水中加入5.6ml?0.58M亞硒酸，5.6ml?1.6M抗壞血酸鈉，振蕩混勻，15分鐘后加溫至42℃，反應1小時，得膠體硒，4℃保存。

10.根據權利要求6所述的制備方法，其特征是，其中步驟④的有色微粒標記抗體通過下述步驟制備：取權利要求8制得的有色微粒膠體溶液100ml用0.1mol/L的碳酸鉀調節pH至中性，加入1/10v/v的抗體溶液，室溫反應15分鐘后，加入聚乙二醇至終濃度為1％，攪拌15分鐘，12000r/min離心30min，棄上清，所得沉淀為純化的微粒標記的抗體，將其復懸于相當于原體積1/5的1％BSA溶液中，4℃保存。