[發(fā)明專(zhuān)利]膠體金免疫浸出和免疫層析結(jié)合快速檢測(cè)藥物殘留的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810033446.9
• 申請(qǐng)日: 2008-02-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101261274A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王學(xué)生;馮吉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 王學(xué)生;馮吉
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/577
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/577;G01N33/544
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明是藥物殘留檢測(cè)方法，應(yīng)用免疫化學(xué)和免疫學(xué)原理，通過(guò)膠體金的免疫反應(yīng)再借助免疫層析技術(shù)達(dá)到檢測(cè)低濃度藥物殘留目的，應(yīng)用于快速檢測(cè)食品和飼料中的藥物殘留。

背景技術(shù)

時(shí)常攝入含獸藥、農(nóng)藥或毒物殘留食品，對(duì)人危害可想而知，例抗生素可使某些菌株產(chǎn)生耐藥性，耐藥菌株又能將耐藥因子傳遞給其他敏感細(xì)胞，使其他異種菌株變成耐藥菌株，導(dǎo)致人體對(duì)抗生素的耐藥性，如長(zhǎng)期食用抗生素殘留的食物，使菌群平衡失調(diào)或引起核黃素缺乏癥和紫癜性損傷，也會(huì)造成三致(致畸、致癌、致突變)。牛乳中抗生素的殘留量達(dá)到相當(dāng)水平，還會(huì)引起酸奶發(fā)酵失敗，給乳品工業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，由此在種植、養(yǎng)殖、飼養(yǎng)、牧業(yè)食品加工等生產(chǎn)領(lǐng)域建立快速準(zhǔn)確檢測(cè)食品中藥物殘留相當(dāng)迫切。目前主要檢測(cè)方法有微生物培養(yǎng)法，酶聯(lián)免疫法，色譜法和膠體金層析法，微生物培養(yǎng)法敏感度低，重復(fù)性差，時(shí)間長(zhǎng)；酶聯(lián)免疫法和色譜法需用設(shè)備、耗時(shí)且必須專(zhuān)業(yè)人員和實(shí)驗(yàn)室才能完成；膠體金層析法，快速簡(jiǎn)便，此方法把標(biāo)記抗體的膠體金顆粒包被在多孔疏松支撐物后干燥，檢測(cè)時(shí)樣品流經(jīng)多孔疏松支撐物并將包被標(biāo)記的膠體金顆粒從多孔疏松支持物溶解下來(lái)，同時(shí)樣本中抗原(藥物殘留)、包被硝酸纖維素膜上的完全抗原和膠體金標(biāo)記的抗體進(jìn)行免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，由于這種免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)在溶解和層析過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行，顯然存在以下問(wèn)題，一是在短時(shí)間內(nèi)標(biāo)記膠體金從支撐物上溶解不徹底，以致免疫反應(yīng)不完全；其次樣品中被測(cè)抗原和包被硝酸纖維素膜上抗原幾乎同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記抗體，這種時(shí)間差小影響了檢測(cè)靈敏；再支撐材料的組織不均勻影響液體的毛細(xì)吸現(xiàn)象導(dǎo)致層析均勻不理想等諸多因素造成此法檢測(cè)靈敏度下降，因此很難通過(guò)膠體金免疫競(jìng)爭(zhēng)層析法檢測(cè)到ppb級(jí)殘留。

本發(fā)明克服膠體金免疫競(jìng)爭(zhēng)層析法的缺陷，采用將標(biāo)記好膠體金抗體包被在類(lèi)似酶聯(lián)反的容器(微孔條筒)內(nèi)，檢測(cè)時(shí)先將被測(cè)樣品和包被在容器上標(biāo)記膠體金顆粒溶出，樣品中的抗原(藥物)同時(shí)和標(biāo)記抗體進(jìn)行充分反應(yīng)，然后把此反應(yīng)液滴加到已包被完全抗原的試條上免疫層析反應(yīng)。這樣解決了膠體金層析法反應(yīng)時(shí)間短、溶解不充分、免疫結(jié)合不完全等造成檢測(cè)靈敏度低的問(wèn)題，使檢測(cè)靈敏度顯著提高，例用同樣原料制成膠體金層析法試劑和本發(fā)明方法制成的試劑，檢測(cè)乳品中相應(yīng)藥物殘留，前者青霉素檢測(cè)到30-40ng/ml，氯霉素10-20ng/ml，四環(huán)素300-400ng/ml，后者分別為3-6ng/ml，0.3-1.0ng/ml，50-100ng/ml，顯然后者能達(dá)到規(guī)定要求，由于此方法兼膠體金層析法的優(yōu)點(diǎn)，快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，此類(lèi)試劑適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，也為家庭食品安檢提供手段。

發(fā)明內(nèi)容

膠體金免疫浸出和免疫層析結(jié)合快速檢測(cè)藥物殘留的方法是，將標(biāo)記好膠體金加入類(lèi)似酶聯(lián)反的容器(微孔條筒)里抽干，檢測(cè)時(shí)先將被測(cè)樣品加入此容器并將在容器(微孔條筒)內(nèi)的膠體金顆粒溶出，然后將混合液滴加到已包被相應(yīng)的完全抗原的試條或試卡上進(jìn)行免疫層析反應(yīng)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程分二步進(jìn)行，即免疫結(jié)合和免疫競(jìng)爭(zhēng)，由于這個(gè)特點(diǎn)，所以反應(yīng)充分，靈敏提高，此方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)是特異性抗原抗體反應(yīng)，所以具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。

本發(fā)明方法是通過(guò)以下技術(shù)方案和工作原理實(shí)現(xiàn)的。特異性抗體標(biāo)記在膠體金顆粒或彩色乳膠顆粒上，標(biāo)記物加到容器內(nèi)抽干，標(biāo)記物便附著在容器內(nèi)壁上；將相應(yīng)完全抗原(藥物-BSA結(jié)合物)包被并固定硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)(T)上，硝酸纖維素膜粘貼在PVC底板上，始端有供加樣用的濾樣墊玻纖，末端有供助層析用的吸水紙組成試條，或?qū)⒃嚄l鑲嵌入塑卡中，組成試劑。檢測(cè)時(shí)，先將被測(cè)樣品加入微孔內(nèi)，把附著在容器壁上的膠體金顆粒溶出、充分混合，同時(shí)如被檢測(cè)樣本含有相應(yīng)的抗原(藥物)與標(biāo)記的膠體金顆粒結(jié)合發(fā)生免疫反應(yīng)，此反應(yīng)液再滴加到試條的加樣濾樣墊玻纖上進(jìn)行免疫層析，由于被測(cè)樣本中相應(yīng)的抗原(藥物)和復(fù)溶的金標(biāo)記抗體發(fā)生了免疫反應(yīng)，此時(shí)混合液層析到檢測(cè)區(qū)上時(shí)包被抗原無(wú)法競(jìng)爭(zhēng)到標(biāo)記抗體，檢測(cè)區(qū)內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)反應(yīng)線(xiàn)，即陽(yáng)性，相反如被測(cè)樣本沒(méi)有被測(cè)抗原(相應(yīng)藥物)，則標(biāo)記的抗體層析到檢測(cè)區(qū)時(shí)和包被膜上的抗原結(jié)合形成紫紅線(xiàn)，即陰性。為了證明試劑有效性和易判讀，分別在質(zhì)控區(qū)(C)包被羊抗兔IgG為質(zhì)控線(xiàn)，所以不管結(jié)果怎樣質(zhì)控線(xiàn)C始終出現(xiàn)。

應(yīng)用本發(fā)明方法制成的試劑由五部分組成：硝酸纖維素膜、吸水紙、濾樣墊玻纖、PVC底板和容器。

硝酸纖維素膜是含有包被在檢測(cè)區(qū)(T)上對(duì)應(yīng)完全抗原(相應(yīng)的藥物-BSA結(jié)合物)的檢測(cè)線(xiàn)，和質(zhì)控區(qū)(C)羊抗兔IgG質(zhì)控線(xiàn)。

吸水紙貼有印有對(duì)應(yīng)測(cè)試藥物的名稱(chēng)，方便用戶(hù)辨認(rèn)品種。

濾樣墊玻纖是用緩沖液處理過(guò)用于調(diào)整樣品pH值的特定濾樣墊玻纖。