[發明專利]一種高含量多種酚酸類化合物的丹參毛狀根及其培養技術

無效

• 申請號: 200810032937.1
• 申請日: 2008-01-23
• 公開（公告）號: CN101491571A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 趙淑娟;王崢濤;胡之璧;周吉燕;張金家
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學
• 主分類號: A61K36/53
• 分類號: A61K36/53;A61K31/216;A61P9/00;A01H4/00;A61K125/00
• 代理公司: 上海新天專利代理有限公司
• 代理人: 王 巍

技術領域

本發明涉及中藥。具體涉及一種高含量多種酚酸類化合物的丹參毛狀根SmHr1及其培養 技術。

背景技術

丹參(Salvia?miltiorrhiza?Bunge)是常用中藥，其藥用部位為根。丹參及以丹參為 主的中藥制劑是臨床治療心血管系統疾病的首選藥之一。除用于飲片外，丹參還是復方 丹參滴丸、復方丹參片、丹參注射液等很多種中成藥的主要原料。

丹參的主要活性成分有丹參酮等二萜醌類化合物和丹酚酸等水溶性酚酸類化合物。 丹酚酸類化合物的藥用價值越來越受到重視，目前已分離的丹酚酸類化合物有二十幾 種，均具有很強的抗過氧化和清除自由基的功能。丹酚酸B鎂鹽作為抑制肝纖維化和 肝硬化的二類新藥已獲得中國國家專利；以丹酚酸B為主要成分的注射用丹參多酚酸 鹽作為治療冠心病和心絞痛的藥物效果顯著；此外，丹酚酸在治療腦血管病基礎與臨床 研究中表現出獨特的作用效果啟示：丹酚酸有望成為抗腦缺血理想藥物。由此可見，丹 酚酸作為治療肝病、心血管疾病和抗腦缺血的有效藥物進入臨床使用，對丹酚酸原料的 需求將會迅猛增加。

若單純依賴丹參的大面積栽培來提取丹酚酸類化合物，不僅占用了耕地，也增大了 提取成本。因此，怎樣應用中藥生物技術，利用丹參毛狀根提高和生產丹酚酸類藥用資 源，是緩解藥材資源壓力的有效途徑。另一方面，這樣對降低丹酚酸制劑的生產成本、 提高制劑質量也具有重要意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是研究設計能獲得穩定產生多種酚酸類化合物的丹參毛 狀根株系，提供高含量丹酚酸制劑的生產原料。

本發明提供了一種高含量多種酚酸類化合物的丹參毛狀根SmHr1。該毛狀根(Hairy root)是本發明人首次由發根農桿菌侵染丹參葉片誘導獲得，因其來源于丹參(Salvia miltiorrhiza?Bunge)，故命名為SmHr1。丹參毛狀根SmHr1在固體培養基和液體培養基 中均呈褐色毛發狀，固體培養時形態略粗壯。其生長失去向地性，且能在不添加任何激 素的MSOH固體培養基及MSOH液體培養基(配方見實施例1)中持續穩定生長繁殖。 并能穩定合成多種丹酚酸類化合物。

本發明的另一目的是提供了上述丹參毛狀根SmHr1的培養方法。

該方法包括下列步驟：

(1)應用YMB液體培養基培養的發根農桿菌(Agrobacterium?rhizogensis)侵染野 生型丹參(Salvia?miltiorrhiza?Bunge)葉片，在MSOH固體培養基中進行培 養，以篩選獲得丹參毛狀根SmHr1；

(2)將毛狀根SmHr1在MSOH固體培養基(配方見實施例1)，25℃，黑暗靜置 培養3～5周后，選取長勢較為粗壯鮮嫩的毛狀根轉接到MSOH液體培養基(配 方見實施例1)中25℃，黑暗，120rpm水平回旋振蕩培養2～4周；再選取 長勢良好的毛狀根轉接到MSOH固體培養基中培養；如此反復，進行3～5次 交替繼代培養，篩選到在MSOH液體培養基中生長快速、遺傳穩定、并能穩 定產生多種酚酸類成分的丹參毛狀根株系SmHr1；

(3)應用持續液體繼代培養(即液體培養基中培養的毛狀根轉接到液體培養基持 續培養的方法)、接種14天后在培養基中添加茉莉酸甲酯，使其終濃度為5～ 30μM，提高丹參毛狀根的生長量積累及藥用成分丹酚酸類化合物的含量。

YMB液體培養基組成(g/L)

Manitol?????????10

Yeast?Extract???0.4

NaCl????????????0.1

MgSO₄·7H₂O?????0.2

K₂HPO₄??????????0.5

用NaOH和HCl調pH至7.2后于121℃高壓滅菌。

MSOH固體培養基組成(mg/L)

(1)大量元素

KNO₃???????????1,900

CaCl₂·2H₂O????440

MgSO₄·7H₂O????370

KH₂PO₄?????????170