[發明專利]豬N－乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法及其應用

無效

• 申請號: 200810031259.7
• 申請日: 2008-05-09
• 公開（公告）號: CN101265475A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 印遇龍;黃瑞林;儲武英
• 申請（專利權）人: 印遇龍
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/70;C07K16/40;G01N33/573
• 代理公司: 長沙永星專利商標事務所
• 代理人: 周詠;米中業

1、一種豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法，其特征是包括如下步驟：

1)克隆豬的NAGS基因，根據該基因序列設計并合成引物：

NAGSF：5′-CGCGCGAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGACATGAAGCCTCTGGTGGTTCTGGGGCTG-3′；

NAGSR：5′-CTGCAGGTCGACTCATTCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCCG-3′，其中Sal1酶切位點5’G’TCGAC?3’，EcoR1酶切位點5’G’AATTC?3’，CATCACCATCACCATCAC為六個組氨酸標簽，通過RT-PCR擴增豬NAGS基因的編碼區序列，其全長為1107bp；

2)將步驟1)獲得的NAGS基因連接入pLM1載體中，并將連接產物轉化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態細胞中，篩選并得到如圖1所示的重組原核表達質粒pLM1-NAGS；

3)將步驟2)獲得的表達全長豬N-乙酰谷氨酸合成酶的重組原核表達質粒pLM1-NAGS轉化到大腸桿菌BL21中；

4)培養步驟3)的大腸桿菌BL21，直到菌液OD值為0.4；

5)在培養的大腸桿菌BL21中加入IPTG?0.2mM，誘導；

6)將誘導后的菌體離心收集，用PBS重懸，加入溶菌酶裂解，再超聲波破碎，把破碎后的菌液離心，收集上清；

7)使用Hitrap?chealting?HP鎳親和層析柱純化蛋白；

8)用純化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作為抗原免疫日本大耳白黑眼兔，得到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗體，用不完全福氏佐劑加強；

9)測抗N-乙酰谷氨酸合成酶的血清效價，取血，得到相應的抗血清。

2、根據權利要求1所述豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟5)中，所述的誘導是在室溫下進行誘導4-6hr。

3、根據權利要求1所述豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟6)的所述純化過程中，所用PBS的pH值為8.0，加溶菌酶裂解的時間為60min，超聲破碎10次×3組，每次6s，每組間隔10s；破碎后的菌液在4℃，8000rpm離心15min，收集上清。

4、權利要求1至3任一項方法所制備的豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體在促進新生仔豬生長的用途，其中通過所述抗體檢測不同日糧水平和不同發育階段豬NAGS基因在體內的分布和表達活性的變化，以尋找內源性精氨酸的營養調節的實用方法。