[發(fā)明專利]一種培養(yǎng)篩選微生物菌種的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810030873.1
• 申請日: 2008-03-24
• 公開（公告）號: CN101250578A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃菊芳;曾樂平
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 中南大學(xué)專利中心
• 代理人: 龔燦凡

1.一種培養(yǎng)篩選微生物菌種的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)樣品處理及DNA抽提：溶解洗滌樣品，收集菌體顆粒物質(zhì)，去雜質(zhì)，收集沉淀物；酚-氯仿-異戊醇抽提沉淀物中的DNA；

2)PCR擴增，克隆、酶切、測序及序列分析，檢測樣品中微生物種類多樣性：分別采用細(xì)菌、古細(xì)菌和真菌通用引物擴增DNA抽提物，擴增產(chǎn)物，純化，純化產(chǎn)物連接克隆后通過藍(lán)白篩選陽性克隆子；對陽性克隆子進行克隆序列的擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切電泳后初步判斷樣品中所含微生物的種類數(shù)；對各種類進行測序分析，獲知樣品中的微生物種類、豐度、生物多樣性和分布規(guī)律；

3)微生物菌種的個性化富集培養(yǎng)：用掃描電鏡分析樣品的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)；用能譜儀、X-射線采集樣品礦物元素的成份及其有機物種類的信息；采集樣品所在的環(huán)境信息，包括溫度、酸堿度、鹽度等；通過序列比對分析，初步判斷各類微生物的種屬及生長特征情況，參照已有的該類微生物的相關(guān)信息；對于新種則參照與之在系統(tǒng)發(fā)育樹中親緣關(guān)系最近的微生物的生長環(huán)境信息；根據(jù)上述信息建立個性化富集培養(yǎng)體系；應(yīng)用個性化富集培養(yǎng)體系富集各類微生物，分離純化各富集分離物，獲得純培養(yǎng)物。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中抽提沉淀物中的DNA的過程為：

①向沉淀物中加入高濃度細(xì)胞裂解液，充分混勻，放入沸水浴中8～15min；

②55～65℃水浴30min以上；

③隨后72℃水浴30min以上；

④加入酚/氯仿/異戊醇混和液，混勻，在室溫下靜置10min左右，離心，將上清液用酚/氯仿/異戊醇重復(fù)抽提，收集上清液；

⑤上清液用-20℃～4℃的無水乙醇沉淀，沉淀溫度為4℃，沉淀時間30min以上，離心收集沉淀；

⑥用濃度為70％的乙醇洗滌沉淀物兩次；

⑦沉淀物置于室溫或真空干燥，用TE或無菌去離子水溶解沉淀，得到基因組DNA提取液。

3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞裂解液各組分的濃度分別為：EDTA：0.10～0.30mol/L；Tris·HCl：0.005～0.15mol/L；NaCl：0.10～0.30mol/L；SDS的質(zhì)量百分濃度為：2％～7.5％；CTAB質(zhì)量百分比濃度為：0.30％～0.75％。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述細(xì)胞裂解液的組成為：pH8.0，1mol/L的Tris·HCl、pH8.0，0.5mol/L的EDTA、5mol/L的NaCl水溶液、質(zhì)量百分比濃度為20％的SDS，質(zhì)量百分比濃度為10％的CTAB，各組分的體積百分比為12.5∶50∶5∶25∶7.5。