[發明專利]一種抗HBV核心區的siRNA表達模板和應用

無效

• 申請號: 200810030726.4
• 申請日: 2008-02-29
• 公開（公告）號: CN101235372A
• 公開（公告）日: 2008-08-06
• 發明（設計）人: 蘇先獅
• 申請（專利權）人: 蘇先獅
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;A61K31/713;A61P31/20
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所
• 代理人: 田嘉嘉

技術領域

本發明涉及基因藥物，具體涉及一種抗HBV核心區的siRNA表達模板。

背景技術

乙型肝炎病毒(HBV)的持續感染是當前嚴重的全球健康問題之一，也是導致慢性肝病最常見的原因。目前全球約有3.5億慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75％分布在亞太地區。慢性乙型肝炎預后不良，可發展為肝硬化和肝癌。目前控制HBV持續感染的抗病毒療法主要采用核苷類似物和重組干擾素類抗病毒藥物。但迄今為止，慢性乙型肝炎的抗病毒治療療效尚不令人滿意，高劑量重組干擾素的持續應答率僅約30％左右，核苷類似物如拉米夫定雖然抗病毒活性較強，但停藥后病毒復制水平快速反跳及耐藥病毒株的出現，使得臨床抗病毒方案的實施受到極大的阻礙。

RNA干預(RNAi)技術的出現為基因功能研究、抗腫瘤和抗病毒基因治療等方面的研究展開了新的一頁。雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干預(RNA?interference，RNAi)，具有干預作用的小片段雙鏈RNA則稱為siRNA，這些小片段一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補結合，會導致mRNA失去功能，即不能翻譯產生蛋白質，也就是使基因“沉默”了。目前RNAi技術主要用于功能基因研究和抗腫瘤研究，抗病毒治療研究才剛剛起步，但已顯示了良好的前景和巨大潛力，如有研究者證實RNAi介導的基因沉寂療法可以成功抑制艾滋病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)的復制與表達。Gitlin等人報道將針對脊髓灰質炎病毒的siRNA導入細胞，可產生抵御病毒感染的保護作用，Novina等人采用針對HIV-1受體CD4的siRNA明顯降低了HIV感染細胞的能力。

基因輸送一直是基因治療和轉基因研究中的一個難題，目前普遍采用腺病毒載體和脂質體-DNA復合物進行基因輸送，而這兩種方法存在著安全隱患和效率低等方面的問題，納米技術在生物領域的滲透形成了納米生物技術，而納米藥物載體的研究是納米生物技術的重點和熱點。被制成基因載體的磁性納米顆粒能與DNA結合，并把DNA導入細胞，在外部磁場導向作用下能達到最佳的細胞轉染作用，完全克服了傳統方法所遇到的困難。

為了進一步研究RNAi對HBV復制的影響，本發明把siRNA技術和納米技術結合，研制了一種新型基因藥物，抑制HBV的復制和表達，這對探索乙肝治療的新途徑具有重要現實意義。

發明內容

本發明的目的在于：克服上述現有技術的不足，通過采用siRNA技術結合納米技術對HBV核心區進行封閉并抑制HBcAg的表達，最終抑制HBV表達和復制。

為實現本發明目的，采用以下技術方案：

一段HBV核心區靶基因的siRNA表達模板的核苷酸序列為：gatcccgttg?gaggcttgaacagtaggatt?gatatccgtc?ctactgttca?agcctccaat?tttttccaaa。將上述表達模板插入到siRNA表達載體中，得到重組表達質粒pRNA-HBcAg，再與磁性納米顆粒結合，通過磁場導入2215細胞，產生靶向HBV核心區的siRNA；經序列測定，它由70個核苷酸組成，與設計相符；經放射免疫法、RT-PCR、western?blotting、免疫組化等體外實驗，表明pRNA-HBcAg可明顯抑制HBV核心區和HBV-DNA的表達，同時也在一定程度上抑制了HBsAg和HbeAg的表達，從而達到抗HBV的目的。

本發明的優點是：

1、靶向廣泛：選擇的靶序列同時針對HBV的adr和adw兩個亞型(這兩個亞型囊括了大部分HBV)，而與人體基因組毫無沖突；

2、納米技術應用：使用磁性納米顆粒作為基因導入的載體，解決了安全性問題，同時利用磁場的作用解決了導向問題，而且納米技術的運用使基因導入的效率有所提高；

3、效果明顯：當前相關RNAi抗HBV的研究大都把靶點設在HBV核心區C端，而本發明設計的RNAi靶點在HBV核心區N端，是其特點。所構建的表達質粒pRNA-HBcAg可明顯抑制HBV核心區的表達，從而抑制HBV的復制和表達，為研制治療乙肝的基因藥物開辟了一條有實用意義的新途徑。

附圖說明

圖1為大腸桿菌轉化后陽性克隆菌落。

圖2為測序圖譜，框內標記的序列為正確的克隆序列。

圖3為siRNA的結構描述。

圖4為熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白GFP表達。

圖5為RT-PCR結果：marker為DNA分子量；

1為空白對照；2為陰性對照；3為pRNA-HBcAg轉染細胞。