[發明專利]一種釀酒酵母多基因表達載體及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 200810029630.6
• 申請日: 2008-07-22
• 公開（公告）號: CN101319225A
• 公開（公告）日: 2008-12-10
• 發明（設計）人: 劉澤寰;臺艷;肖文娟;王峻梅
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/69
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 何淑珍

1.一種釀酒酵母多基因表達載體，其特征在于該表達載體是將釀酒酵母基因組rDNA1.8kb片段、磷酸甘油激酶啟動子和磷酸甘油激酶終止子三個表達元件插入到大腸桿菌-釀酒酵母穿梭表達載體中，并在磷酸甘油激酶啟動子上游和磷酸甘油激酶終止子下游設計同尾酶的酶切位點，即得釀酒酵母多基因表達載體；

所述的釀酒酵母基因組rDNA1.8kb片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述的磷酸甘油激酶啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述的磷酸甘油激酶終止子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

2.根據權利要求1所述的釀酒酵母多基因表達載體，其特征在于所述同尾酶為Nhe?I、Xba?I。

3.權利要求1所述的釀酒酵母多基因表達載體的構建方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

(1)引物設計與表達元件的擴增：根據釀酒酵母的基因組序列，設計釀酒酵母基因組rDNA1.8kb片段、磷酸甘油激酶啟動子和磷酸甘油激酶終止子的特異性擴增引物，并以釀酒酵母AS?2.489菌株的基因組DNA為模板，分別擴增釀酒酵母基因組rDNA1.8kb片段、磷酸甘油激酶啟動子和磷酸甘油激酶終止子；

(2)將上述磷酸甘油激酶啟動子的擴增產物和大腸桿菌-釀酒酵母穿梭表達載體同時雙酶切后，將磷酸甘油激酶啟動子的擴增產物連接入大腸桿菌-釀酒酵母穿梭表達載體，獲得第一次連接產物；

(3)將上述磷酸甘油激酶終止子的擴增產物與上述第一次連接產物同時雙酶切后，將磷酸甘油激酶終止子的擴增產物連接入第一次連接產物，得到第二次連接產物；

(4)將上述釀酒酵母基因組rDNA1.8kb片段的擴增產物和上述第二次連接產物同時雙酶切后，將釀酒酵母基因組rDNA1.8kb片段的擴增產物連接入第二次連接產物，即得釀酒酵母多基因表達載體。

4.根據權利要求3所述釀酒酵母多基因表達載體的構建方法，其特征在于：步驟(2)中，所述雙酶切的酶切位點為Sal?I、BamHI；步驟(3)中，所述雙酶切的酶切位點為Xba?I、BamH?I；步驟(4)中，所述雙酶切的酶切位點為Sac?I、Xba?I；步驟(2)、步驟(3)和步驟(4)中，所述連接為DNA連接酶連接。

5.權利要求1所述的釀酒酵母多基因表達載體在表達多種外源基因方面的應用。