[發明專利]一個小分子非編碼RNA基因hsa－miR－101及其抗腫瘤用途

無效

• 申請號: 200810029014.0
• 申請日: 2008-06-25
• 公開（公告）號: CN101333524A
• 公開（公告）日: 2008-12-31
• 發明（設計）人: 莊詩美;蘇杭;楊建榮;楊金娥;程家森
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;A61K31/7088;A61P35/00
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人: 華輝

技術領域

本發明涉及一個與原發性肝癌相關的小分子非編碼RNA基因hsa-miR-101，以及該基因在輔助診斷與治療原發性肝細胞癌方面的用途。該發明屬于生物技術領域。

技術背景

原發性肝細胞癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，我國是肝癌的主要發生地，肝癌的發生率高達十萬分子三十五。近年來肝癌發病率有明顯上升的趨勢，嚴重危害人類的健康與生命安全。

微小RNA(microRNA)是廣泛存在于各種生物物種內的一類小分子非編碼的核糖核酸，其長度約為20-22個堿基。它不編碼蛋白質或多肽，而是通過與靶基因的mRNA(信使RNA)的3’UTR(3’端非翻譯區)的特異性結合，促進其降解或抑制其翻譯過程來實現對基因表達的調控。許多證據表明，microRNA參與了細胞的多種生物學過程，其自身調控的異常直接影響著惡性腫瘤的發病及惡化。由于microRNA與腫瘤發生的密切關系，它們在腫瘤診斷和治療中可能具有極為廣闊的應用前景。

我們首先利用cDNA芯片技術高通量檢測了HCC與對照標本中存在的miRNA表達改變。通過比較癌與非癌肝組織中miRNA表達譜的差異，我們鑒定了41個在肝癌中表達發生顯著改變的miRNA，并選取了其中的hsa-miR-101進行較深入的功能探討。結果發現hsa-miR-101在70％以上的HCC病例中以及所有肝癌細胞株中均低表達，提示hsa-miR-101可能具有抑癌基因活性。進一步的實驗結果表明，過表達hsa-miR-101可提高腫瘤細胞對血清饑餓和多種化療藥物包括curcumin、etoposide和doxorubicin的敏感性。我們還發現，hsa-miR-101可有效抑制腫瘤細胞體外的集落形成能力以及體內的成瘤能力。這些結果表明hsa-miR-101不僅可作為臨床上肝癌診斷的輔助指標，而且在肝癌治療中有著非常廣闊的應用前景。

經對現有技術的國內外文獻檢索，至今未見有關hsa-miR-101與原發性肝癌的研究報道。

發明內容

本發明公開了一種能有效抑制肝癌細胞增殖、促進肝癌細胞凋亡的小分子RNA基因hsa-miR-101，及其在原發性肝癌診斷和治療方面的用途。該基因成熟體序列有以下核苷酸組成：

5’-AUGUCAUUUAAUUACUUAAGC-3’

首先，本發明的小分子RNA基因hsa-miR-101在大多數肝癌組織中下調明顯，因此在肝癌的臨床診斷及預后判斷方面，有重要的參考意義；

其次，本發明的小分子RNA基因可以有效降低肝癌細胞的增殖及成瘤能力，可有效促進肝癌細胞對血清饑餓及各種化療藥物的敏感性，因此是一種全新作用機制的抗腫瘤藥物，在肝癌治療中有極為重要的應用前景。

附圖說明

圖1：Northern?blot檢測hsa-miR-101的表達水平。A，hsa-miR-101在不同細胞株，人非肝癌組織(N699)以及成年小鼠正常肝(mLiv)中的表達水平；B，hsa-miR-101在成對的肝癌(T)與癌旁(P)組織中表達水平的比較。

圖2：hsa-miR-101能提高細胞對凋亡刺激的敏感性。A，在血清饑餓環境下，過表達hsa-miR-101促進HepG2細胞的凋亡；B，過表達hsa-miR-101后HepG2在血清饑餓時的細胞活力明顯下降；C，在血清饑餓環境下，過表達hsa-miR-101導致HepG2細胞caspase-3/7活性提高，此作用可被hsa-miR-101的抑制劑回復，D，hsa-miR-101導致不同肝癌細胞株對血清饑餓誘導的凋亡敏感；E，hsa-miR-101促進HepG2細胞在不同化療藥物刺激下的凋亡，其中用etoposide，curcumin及doxorubicin的處理濃度和時間分別為1.5μg/ml，48hrs；12.5μM，48hrs；0.2μg/ml，36hrs。關于實驗組組間差異的比較，除圖中用明確標識的比較組別外，其余均是對hsa-miR-101與平行的細胞組或NC進行的比較。數據來自三次獨立實驗。*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。

圖3：過表達hsa-miR-101顯著抑制了HepG2細胞在裸鼠的皮下成瘤能力，圖示4周后腫瘤的形成情況代表圖。

具體實施方式

以下結合具體實施例，來進一步說明本發明。需要注意的是，以下實施例只用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。本發明所述的hsa-miR-101可以采用常規的化學合成方式合成。

實施例1：hsa-miR-101在肝癌組織標本中表達水平的檢測