[發(fā)明專(zhuān)利]人工重組的五聯(lián)體蛋白A及其構(gòu)建方法與用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810028706.3
• 申請(qǐng)日: 2008-06-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101298475A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳校園;余波光;彭濤;張旭鋒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州康盛生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/31
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/31;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/21;C12N15/10;C12P21/02;C07K1/22
• 代理公司: 珠海智專(zhuān)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 許淑文

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人工重組的五聯(lián)體蛋白A以及其構(gòu)建方法與用途。

背景技術(shù)

蛋白A的發(fā)現(xiàn)從一開(kāi)始就與IgG(免疫球蛋白G)相關(guān)聯(lián)，早在1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種在雙向擴(kuò)散試驗(yàn)中能與正常人血清形成沉淀的物質(zhì)。Jensen(1959)也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象，并將其命名為A抗原。直到1963年Lofkvist等分離了該抗原，并證明它是一種蛋白質(zhì)。為與糖相區(qū)別，Grov(1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡(jiǎn)稱(chēng)SPA或蛋白A。1978年，有研究者將加熱滅活并經(jīng)福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌用于一種癌癥的治療，顯示出一定的療效，這是世界上第一次利用蛋白A的抗體吸附性治療相關(guān)疾病的報(bào)道。Uhlen等在1984年闡明了蛋白A的全基因序列和相應(yīng)的氨基酸序列。2003年，L.Yang等應(yīng)用表面張力探針證明每個(gè)蛋白A分子可結(jié)合兩個(gè)IgG分子。SPA基因的核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列已有報(bào)道(Uhlén?M，Guss?B，Nilsson?B，Gatenbeck?S，Philipson?L，Lindberg?M.Complete?sequence?of?thestaphylococcal?gene?encoding?protein?A.A?gene?evolved?through?multipleduplications.J?Biol?Chem.1984?Feb?10；259(3)：1695-702.)。

蛋白A的基因編碼序列由1464個(gè)堿基組成(若加上氨基端信號(hào)肽序列則為1572個(gè)堿基)，共編碼488個(gè)氨基酸，分子量約42KD。整個(gè)SPA分子包含六個(gè)結(jié)構(gòu)域：E、D、A、B、C和X(從氨基端至羧基端)，其中，E、D、A、B、C這五個(gè)結(jié)構(gòu)域均具備結(jié)合IgG的能力。X結(jié)構(gòu)域的作用是將蛋白A嵌合入金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁。

蛋白A主要被應(yīng)用于科研領(lǐng)域的抗體分離和純化，其產(chǎn)品來(lái)源主要是從金黃色葡萄球菌中提純而得到的天然蛋白A，例如，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的天然蛋白A(進(jìn)口SPA)。由于金黃色葡萄球菌是致病菌，且蛋白A在該菌體的含量并不高(約占細(xì)胞壁蛋白成分的6.7％)，因此，從發(fā)酵培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌中提純蛋白A的方法風(fēng)險(xiǎn)較大且難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要。近年來(lái)，人們開(kāi)始轉(zhuǎn)向采用基因工程法來(lái)生產(chǎn)蛋白A，尋求既能避免致病菌的危險(xiǎn)，又能大規(guī)模生產(chǎn)蛋白A的可行而有效的途徑。

名稱(chēng)為“重組蛋白A基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備與應(yīng)用”的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枺?3105360.2，申請(qǐng)日：2003年2月26日，公開(kāi)號(hào)：CN1432578，公開(kāi)日：2003年7月30日)以及名稱(chēng)為“重組蛋白A基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備與應(yīng)用”的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枺?3149982.1，申請(qǐng)日：2003年8月1日，公開(kāi)號(hào)：CN1524957，公開(kāi)日：2004年9月1日)公開(kāi)了一種化學(xué)合成的重組蛋白A，所涉及的重組蛋白A基因是以3個(gè)人工合成的重組蛋白A基因單體串連而成，各重組蛋白A基因單體間以AccI酶切位點(diǎn)相連，可插入表達(dá)載體pBV220中表達(dá)。該專(zhuān)利申請(qǐng)所構(gòu)建的重組蛋白A為178個(gè)氨基酸。

名稱(chēng)為“一種重組蛋白A基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備方法和用途”的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枺?00710085148.X，申請(qǐng)日：2007年3月14日，公開(kāi)號(hào)：CN101050464，公開(kāi)日：2007年10月10日)公開(kāi)了另一種化學(xué)合成的重組蛋白A，提供的重組蛋白A基因是以3個(gè)人工合成的重組蛋白A基因單體串連而成，各單體間以AccI酶切位點(diǎn)相連，可插入表達(dá)載體pET32a中表達(dá)。該專(zhuān)利申請(qǐng)所構(gòu)建的重組蛋白A為180個(gè)氨基酸。

從已公開(kāi)的上述專(zhuān)利申請(qǐng)看，他們都選擇了用三個(gè)單體串聯(lián)重組為蛋白A的方法，且都選擇了同樣的AccI酶切位點(diǎn)來(lái)連接，可在常見(jiàn)的表達(dá)載體如pBV220和pET32a中表達(dá)。盡管這兩種重組蛋白的氨基酸殘基數(shù)量比較接近，但它們的具體序列是有明顯差別的。第三個(gè)專(zhuān)利申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)中，可以看到該重組蛋白A與市售天然產(chǎn)品的性能比較；而在前兩個(gè)專(zhuān)利申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)中，則看不到有關(guān)比較的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本發(fā)明人基于對(duì)已申請(qǐng)專(zhuān)利的產(chǎn)品的對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)品的性能實(shí)際上弱于天然產(chǎn)品，因而不能滿足抗體分離純化的應(yīng)用要求，尤其是隨著免疫吸附血液凈化技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)蛋白A的抗體吸附性能提出了更高的要求。因此，如何使基因工程生產(chǎn)的重組蛋白A的活性接近甚至達(dá)到天然蛋白A的水平，仍然是擺在科研工作和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用面前的一道難題。

發(fā)明內(nèi)容