[發明專利]一種克百威的酶聯免疫檢測方法和試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 200810028633.8
• 申請日: 2008-06-06
• 公開（公告）號: CN101290316A
• 公開（公告）日: 2008-10-22
• 發明（設計）人: 孫遠明;楊金易;王弘;吳青;雷紅濤;沈玉棟;肖治理;柳春紅;劉細霞
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N21/25;G01N33/543
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明;任重

1、一種克百威的酶聯免疫檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)將克百威抗原包被于固相載體上；

(2)加入標樣或待測樣品，再加入克百威雙功能基因工程抗體反應；

(3)加入底物液進行顯色加以測定百分吸光度值；根據標準曲線，和待檢樣品的百分吸光度值，推算出待測樣品中克百威的濃度。

2、根據權利要求1所述克百威的酶聯免疫檢測方法，其特征在于步驟(1)所述固相載體為酶標板，包被有能與克百威雙功能基因工程抗體特異結合的克百威抗原，并封閉微孔表面未吸附位點；步驟(2)所述克百威雙功能基因工程抗體為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶克百威雙功能基因工程抗體，基因工程抗體為Fab、Fv、ScFv或單域抗體。

3、根據權利要求1或2所述克百威的酶聯免疫檢測方法，其特征在于當酶為辣根過氧化物酶時，所述底物液為含有3，3，5，5-四甲基聯苯胺或鄰苯二胺的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液、底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液、所述終止液為1～2mol/L硫酸溶液；當酶為堿性磷酸酯酶時，底物液為pH9.8的4-硝基酚磷酸鈉鹽(PNPP)二乙醇胺溶液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉溶液。

4、一種實現權利要求1所述克百威的酶聯免疫檢測方法的試劑盒，其特征在于由以下部分組成：

(1)試劑盒盒體；

(2)包被克百威抗原的酶標板，1塊；

(3)克百威雙功能基因工程抗體工作液，1瓶；

(4)克百威標準品溶液，共6瓶；

(5)底物液，1瓶；

(6)底物緩沖液，1瓶；

(7)終止液，1瓶；

(8)濃縮洗滌液，1瓶；

(9)使用說明書，1份；

(10)蓋板膜，2張；

(11)含干燥劑的自封袋，1個。

5、根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述盒體為硬紙盒；所述酶標板是96孔或40孔的聚苯乙烯酶標板，放于鋁鉑袋內；所述蓋板膜采用不透明塑料貼紙；標準溶液、克百威雙功能基因工程抗體、底物液、底物緩沖液、終止液和濃縮洗滌液分別采用不同顏色蓋的透明塑料瓶分裝；所述試劑盒盒內設有內墊，內墊設下凹瓶位，采用塑料泡沫材料。

6、根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為含0.5～1.5％吐溫20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH值為7.4，濃度為0.1mol/L；所述6瓶克百威標準品溶液濃度分別為0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L和8.1μg/L；所述6瓶克百威標準品溶液每瓶1mL；所述克百威雙功能基因工程抗體工作液體積為7mL，底物液體積為7mL，底物緩沖液體積為7mL，終止液體積為7mL，濃縮洗滌液體積為50mL。

7、一種權利要求4所述試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)制備克百威雙功能基因工程抗體；

(2)制備包被克百威抗原的酶標板；

(3)按要求配制所需溶液并分裝；

(4)組裝試劑盒。

8、根據權利要求7所述試劑盒的制備方法，其特征在于步驟(1)所述制備克百威雙功能基因工程抗體包括以下步驟：

(a)提取克百威單克隆細胞或經克百威免疫原免疫后的小鼠脾細胞的RNA，反轉錄為cDNA，設計抗體輕重鏈與連接肽的擴增引物，利用PCR技術擴增出抗體的輕重鏈基因并將其連接起來，將其插入適當的表達質粒，在大腸桿菌中表達，利用免疫親和方法進行純化，純度由SDS-PAGE電泳鑒定；

(b)以重組噬菌體陽性克隆質粒為模板，PCR擴增抗克百威基因工程抗體片段；經酶切，純化，亞克隆到攜帶辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AP基因的載體pPhoA(+)，轉化大腸桿菌，抗性篩選，獲得重組大腸桿菌陽性克隆；誘導雙功能基因抗體的表達得到克百威雙功能基因工程抗體。