[發(fā)明專利]一種緩釋生物活性多肽的方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810028614.5
• 申請日: 2008-06-06
• 公開（公告）號: CN101294187A
• 公開（公告）日: 2008-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李弘劍;蘇正定;周天鴻
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;A61K38/26;A61K38/23;A61K38/17;A61P3/10;A61P19/10;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 何淑珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種以血漿蛋白酶或者血液的微堿性 pH為基礎(chǔ)緩釋生物活性多肽的方法與應用。

背景技術(shù)

多肽在水溶液中沒有特定的三維空間結(jié)構(gòu)。分子量小于6千道爾頓的多 肽可通過特異性地結(jié)合細胞信號途徑中的蛋白質(zhì)受體或者適配體來發(fā)揮獨特 的生物作用。因此，在獲得有效的小分子藥物之前，對于那些迫切需要治療的 疾病，例如糖尿病、癌癥、艾滋病等，肽或者多肽類似物作為能夠靶向性作用 于那些偏軌的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)信號作用，將是治療這類疾病的有效手段。然而， 肽類藥物易被血漿蛋白酶水解，并被清除出體循環(huán)系統(tǒng)，使得它們的半衰期縮 短而在臨床使用中受到限制。因此，需要通過改善這些肽類的藥物代謝動力學 特性，以增強這些肽類藥物在體內(nèi)的功效。

目前的許多方法中，把一個生物活性蛋白(這個蛋白在給藥以后易被清除) 和一個血漿蛋白(這個蛋白是自然存在的，具有低的清除率)偶聯(lián)在一起，是 一種有前景提高生物活性肽半衰期的策略(Sheffield?WP，Cardiovacs?Haematol Disord?1，1-5，2001)這種融合蛋白臨床應用的優(yōu)勢是能夠減少藥物注射的頻率 和提高藥物在體內(nèi)的濃度。一些病原體為免遭排斥而進化獲得了特異性地結(jié)合 到免疫球蛋白、白蛋白、纖維結(jié)合蛋白或者纖維蛋白素原等循環(huán)的蛋白質(zhì)衍生 物分子，以上策略與這種病原體的策略相似。

實際應用中，具有治療作用的蛋白質(zhì)或者肽往往是通過與血清白蛋白結(jié)合 來改善其自身的半衰期短的藥物代謝動力學性質(zhì)。血清白蛋白是哺乳動物血液 循環(huán)系統(tǒng)中最豐富的蛋白(人的血液中含量為40g/L)。人血清白蛋白廣泛地 分布于身體地各個部分，特別是在腸和血液這兩個部分，在血液中，它主要與 維持滲透壓有關(guān)。人血清白蛋白是一種天然的載體，它參與內(nèi)源性的運輸，它 能夠傳送數(shù)目眾多的天然存在的分子，同樣它也能夠傳送治療的分子(Sellers 等，Albumin?Structure，F(xiàn)unction?and?Uses，eds?by?Rosenoer?VM?et?al，Pergamon， Oxford，p159，1977)。結(jié)合脂類、膽紅素等分子就是它的功能之一。人血清白 蛋白的半衰期是19天(McCurdy?TR?et?al，J?Lab?Clin?Med?143，115-120，2004)。 這為延長治療用的蛋白質(zhì)或者多肽在體循環(huán)半衰期提供了一種有希望的方法。 把蛋白直接共價的偶聯(lián)到血清白蛋白上，或者連接到能夠與血清白蛋白相互作 用的肽或者蛋白上，這兩種策略都已經(jīng)被報道，且都能夠?qū)е碌鞍自隗w內(nèi)的半 衰期的延長。利用白蛋白結(jié)合肽或者鏈球菌G蛋白的衍生物來延長在血液中 的清除率很高的蛋白的半衰期(EP486525；US?6267964)。Roland?Stork等 報道了將抗體與鏈球菌G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)融合而改善抗體 的藥代動力學特性的策略(Roland?Stork，Dafne?Müller和Roland?E.Kontermann’ Protein?Engineering?Design?and?Selection，doi：10.1093/protein/gzm061)。這個策 略也用于單鏈雙特異性抗體(scDb?CEACD3)，融合抗體能夠把細胞毒性T淋巴 細胞導向到表達CEA的腫瘤細胞。這種新穎的具有三種功能的融合蛋白 (scDb-ABD)可在哺乳動物細胞中被表達，且它能夠同時識別人和鼠血清白蛋 白這兩種抗原。這個策略只增加了一個小的蛋白結(jié)構(gòu)域(即46個氨基酸)，利 用了與血清白蛋白的高親和力的非共價的相互作用，有希望將被廣泛地用于改 善小的重組抗體分子的血清半衰期。Dafne?Müller等構(gòu)建了一些重組的雙特異 性的抗體和血清白蛋白的融合蛋白，并分析了這些分子的生物活性和藥代動力 學性質(zhì)(Dafne?Müller，Anette?Karle，Bettina?Meiβburger，Ines?，Roland?Stork， 和Roland?E.KontermannJ.Biol.Chem.，282，12650-12660，2007)。重組抗體的三 個部分是由兩個不同的scFv分子，雙特異性的scDb或者taFv分子分別與人 血清白蛋白融合而成。這些重組體抗體(scFv₂-HSA，scDb-HSA，taFv-HAS)能 夠直接與腫瘤抗原、癌胚抗原以及T細胞受體復合物CD3相互作用，而且它 們保留了未融合的所有結(jié)合能力。Dennis等利用噬菌體展示肽文庫篩選出相 對較短的多肽來結(jié)合到血清白蛋白上，這些肽能夠與血清白蛋白結(jié)合，同時它 們與具有腫瘤靶向性的生物活性化合物相連(Mark?S.Dennis，Min?Zhang，Y. Gloria?Meng，Miryam?Kadkhodayan，Daniel?Kirchhofer，Dan?Combs，和Lisa?A. Damico，J?Biol?Chem?277，35035-35043，2002)。這些融合物的半衰期比單獨 生物活性肽長，并與那些由PEG共價修飾的生物活性肽分子的半衰期相當。 另一方面，血清白蛋白融合物提供了一種新的普遍適用的方法，這個方法能夠 改善那些被快速清除的蛋白的藥代動力學特性。Dennis等還利用抗體Fab4D5， 即一個從單抗trastuzumab(HERCEPTIN)中獲得的雙功能分子，它能夠同時結(jié) 合血清白蛋白和腫瘤抗原HER2(erbB2)(Mark?S.Dennis，Hongkui?Jin，Debra Dugger，Renhui?Yang，Leanne?McFarland，Annie?Ogasawara，Simon?Williams， Mary?J.Cole，Sarajane?Ross?and?Ralph?Schwall，Cancer?Res，67，254-61，2007)。 更重要的是，AB.Fab4D5不會像Fab4D5那樣在腎臟中蓄積，這說明這個雙功 能分子與血清白蛋白的相互作用改變了它的清除路徑和新陳代謝途徑。快速的 靶向作用，優(yōu)良的腫瘤沉淀和滯留可能使AB.Fab成為一個用于成像和腫瘤治 療的特殊分子。Vladimir?Tolmachev等報道說，通過與血清白蛋白的可逆結(jié)合 能夠有效地降低腎臟的排泄和吸收(Vladimir?Tolmachev，Anna?Orlova等， Cancer?Res，67，2773-82，2007)。