[發明專利]老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 200810028601.8
• 申請日: 2008-06-06
• 公開（公告）號: CN101357227A
• 公開（公告）日: 2009-02-04
• 發明（設計）人: 姚志彬
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K48/00;C12N15/12;C12N15/861;C12N7/01;A61P25/28;A61K38/17
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 程躍華

1.一種老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗，為分泌性共表達柔性可折疊的多價Aβ_1-15及基因佐劑的重組腺病毒疫苗，其中，所述Aβ_1-15氨基酸序列為：SEQ?ID?No.1：Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln采用柔性連接肽連接多價Aβ_1-15。

2.根據權利要求1所述的一種老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗，其特征在于所說的柔性連接肽的序列為：

Gly-Gly或Gly-Ser。

3.根據權利要求1或2所述的一種老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗，其特征在于所說的Aβ_1-15氨基酸序列為四價，即4×Aβ_1-15。

4.根據權利要求1或2所述的一種老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗，其特征在于所說的基因佐劑為人粒-巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF。

5.如權利要求1的老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗的制備方法，包括如下步驟：

(1)合成多條寡核苷酸引物，通過基因擴增得到的兩個或以上含有柔性連接肽基因的二價Aβ_1-15基因片斷；

SEQ?ID?No.2：

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Gly-Gly-

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln，即2×Aβ_1-15；

(2)將兩個或以上含有柔性連接肽基因的二價Aβ_1-15基因片斷依次克隆入質粒pcDNA3.1，制備重組質粒pcDNA3.1-s4×Aβ_1-15；酶切pcDNA3.1-s4×Aβ_1-15質粒，回收純化s4×Aβ_1-15片斷；

(3)合成多條寡核苷酸引物，PCR擴增出GM-CSF基因片斷或白細胞介素-4基因片斷、IRES基因片斷；

(4)將從重組質粒pcDNA3.1-s4×Aβ₁₅酶切出的4×Aβ₁₅基因片斷及(3)中經酶切純化的基因片斷依次克隆入pShuttle-CMV質粒中制備pShuttle-4×Aβ₁₅-IRES-GMCSF重組穿梭載體；

(5)利用pAdEasy系統，同源重組后，在人胚胎腎293A細胞中包裝出重組腺病毒Ad-4×Aβ₁₅；

(6)通過氯化銫密度梯度低溫超高速離心純化重組腺病毒Ad-4×Aβ₁₅，并進行滴度測定；

其中pcDNA3.1-s4×Aβ₁₅質粒的構建方法為：

1.1設計插入pcDNA3.1的四價B細胞抗原表位片段4×Aβ₁₅序列

Kozak+signal?peptide?IgGκ+Aβ_1-15+GG+Aβ_1-15+GS+Aβ_1-15+GG+Aβ_1-15；

1.2Kozak+IgGκsignal?peptide+Aβ_1-15+GG+Aβ_1-15+GS，即2×Aβ_15-1片段的引物設計

P1引物：SEQ?ID?No.3：5’-GAT?GCA?GAA?TTC?CGA?CAT?GAT?TCA?GGATAT?GAA?GTT?CAT?CAT?CAAGAT?GCA?GAA?TTC?CGA?CAT?GATTCA?GGA?TAT?GAA?GTT?CAT?CAT?CAAGGG-3’；斜體加粗為甘氨酸連接肽，甘氨酸連接肽前后分別為Aβ₁₅堿基序列，加粗為BamH?I酶切位點，下劃線為引物配對的堿基；

P2引物：SEQ?ID?No.4：5’-CCCTTG?ATG?ATG?AAC-3’；加粗為BamH?I酶切位點，下劃線為引物配對的堿基；

P3引物：SEQ?ID?No.5：5’TGG?GTA?CTG?CTG?CTC?TGG?GTT?CCA?GGTTCC?ACT?GGT?GAC?GAT?GCA?GAA?TCC?CGA?CAT-3’；下劃線為引物配對的堿基；

P-4引物：SEQ?ID?No.6：5’-GGGAG?ACA?GACACA?CTC?CTG?CTA?TGG?GTA?CTG?CTG?CTC?TGG-3’；加粗為KpnI酶切位點，斜體為Kozak序列，下劃線為引物配對的堿基；

1.3GS+Aβ_1-15+GG+Aβ_1-15，即2×Aβ_15-2片段的引物設計

P5引物：SEQ?ID?No.7：5’-GGGGAT?GCAGAATTC?CGA?CATGAT?TCA?GGA?TAT?GAA?GTT?CAT?CAT?CAAGAT?GCA?GAA?TTCCGA?CAT?GAT?TCA?GGA?TAT?GAA?GTT?CAT?CAT?CAA?TGA-3’；斜體加粗為甘氨酸連接肽，甘氨酸連接肽前后分別為Aβ₁₅堿基序列，加粗分別為BamHI和Xho?I酶切位點，下劃線為引物配對的堿基；

P6引物：SEQ?ID?No.8：5’-CCGTCA?TTG?ATG?ATG-3’；加粗為Xho?I酶切位點，下劃線為引物配對的堿基；

1.42×Aβ_15-1片段的擴增

P2，P3為引物，以合成的P1引物為模板，Ex?Taq酶，94℃預變性5min，然后94℃變性45s；52℃退火30s；72℃延伸45s，30次循環；最后72℃延伸7min，擴增P2×Aβ_15-1片段；然后，P2×Aβ_15-1片段為模板，P2，P4為引物，相同PCR條件擴增2×Aβ_15-1片段；1.5％的瓊脂糖電泳觀測擴增結果，PCR產物純化試劑盒純化；

1.5?2×Aβ_15-2片段的擴增

P5，P6為引物及模板，Ex?Taq酶，94℃預變性5min，然后94℃變性45s；52℃退火30s；72℃延伸45s，30次循環；最后72℃延伸7min，擴增2×Aβ_15-2片段；

1.6pcDNA3.1-4×Aβ₁₅的構建

用Kpn?I和BamH?I雙酶切2×Aβ_15-1片段和pcDNA3.1；回收線狀pcDNA3.1載體與2×Aβ_15-1片段，T₄?DNA連接酶，16℃過夜連接，轉化感受態E.coli?DH5a，挑選轉化子，含氨芐青霉素的LB培養基過夜培養，Omega質粒小量制備Kit提取質粒，用KpnI/BamHI于37℃雙酶切鑒定，陽性重組子命名為pcDNA3.1-2×Aβ_15-1；同樣，用BamH?I和Xho?I雙酶切2×Aβ_15-2片段和pcDNA3.1-2×Aβ_15-1，以同樣的方法獲得陽性重組子pcDNA3.1-4×Aβ₁₅；

pShuttle-4×Aβ₁₅-IRES-GMCSF重組穿梭載體的構建方法為：

2.1IRES片斷的引物設計

P1引物：SEQ?ID?No.9：CCGCTCGAGAATTCCGCCCCTCTCCCT；后18個堿基為IRES上的堿基序列，下劃線為XhoI酶切位點；

P-2引物：SEQ?ID?No.10：ACGCGTCGACCATATTATCATCGTGTT；后18個堿基為IRES上的堿基序列，下劃線為SalI酶切位點；

2.2hGM-CSF基因片斷的引物設計

P3引物：

SEQ?ID?No.11：

CCGCTCGAGAAGCTTGTCGACCACAACCATGTGGCTGCAGAGCCTG；后18個堿基為hGM-CSF上的堿基序列，下劃線分別為XhoI和SalI酶切位點；

P4引物：

SEQ?ID?No.12：CGGATATCTCACTCCTGGACTGGCTC；后18個堿基為hGM-CSF上的堿基序列，下劃線為EcoRV酶切位點；

2.3pShuttle-s4×Aβ₁₅的構建

以KpnI和XhoI雙酶切本課題組構建的pcDNA3.1-s4×Aβ₁₅質粒并切膠回收s4×Aβ₁₅片斷，同樣雙酶切純化pShuttle-CMV載體；連接，轉化感受態E.coliDH5a，陽性重組子命名為pShuttle-s4×Aβ₁₅；

2.4pShuttle-s4×Aβ₁₅-GM-CSF的構建

抽取健康人血液，淋巴細胞分離液提取人淋巴細胞培養，ConA刺激72h后提取細胞總RNA，逆轉錄并以P3和P4為引物PCR擴增hGM-CSF基因片斷；XhoI和EcoRV雙酶切純化的hGM-CSF基因片斷和pShuttle-s4×Aβ₁₅重組子，連接，轉化感受態E.coli?DH5a；陽性重組子命名為pShuttle-s4×Aβ₁₅-GMCSF；

2.5pShuttle-s4×Aβ₁₅-IRES-GMCSF重組穿梭質粒的構建

以pShuttle-IRES-hrGFP-1為模板，以P1和P2引物PCR擴增IRES基因片斷；XhoI和SalI雙酶切純化的IRES基因片斷和pShuttle-s4×Aβ₁₅-GMCSF重組子，連接，轉化感受態E.coli?DH5a；陽性重組子命名為pShuttle-s4×Aβ₁₅-IRES-GMCSF。

6.根據權利要求5所述的老年性癡呆重組腺病毒基因疫苗的制備方法，其特征在于第一個二價Aβ₁₅基因之前含有Kozak序列及小鼠IgGκ輕鏈信號肽序列。