[發明專利]基于環介導等溫擴增技術的單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200810027759.3
• 申請日: 2008-04-29
• 公開（公告）號: CN101307351A
• 公開（公告）日: 2008-11-19
• 發明（設計）人: 石磊;曹以誠;杜正平;陳洵;譚慧媚;趙長臣;劉妙琴;李心暉
• 申請（專利權）人: 廣州華峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳衛

1、一種單核增生李斯特菌基因快速診斷試劑盒，其特征在于由兩對引物、Bst?DNA聚合酶、反應液、穩定液、樣品預處理液、顯色液和陽性對照液組成，以上七種液體分別置于容器中，

上述兩對引物為：

外引物F3：ACAAGACTTCACCAATCCA；

外引物B3：GTCTTTTAAGTGGAGTAAACCTT；

內引物FIP：TAAGTCTCTTTGCAATTGACCGACTTTTACGTGTACACAGAAAAGCG；

內引物BIP：CCTGTGCCAAAGCATTTTTACATTTTTTAGGCAAGTCATCTTGTTCG；

上述反應液含有1.6～2mmol/L?dNTP、20～25mmol/L?Tris-Cl、10～12.5mmol/L氯化鉀、10～12.5mmol/L硫酸銨、8～10mmol/L硫酸鎂、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L；

上述樣品預處理液含有10～20mmol/L?pH?8.0的Tris-HCl、1～2mmol/L?EDTA和1～1.2％Triton?X-100；

上述陽性對照為單核增生李斯特菌基因組DNA。

2、根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述顯色液為SYBRGreen?I。

3、根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述樣品預處理液含有20mmol/L?pH?8.0的Tris-HCl、2mmol/L?EDTA和1.2％?Triton?X-100。

4、根據權利要求1所述試劑盒，其特征在于所述反應液含有2mmol/L?dNTP、25mmol/L?Tris-Cl、12.5mmol/L氯化鉀、12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125％TritonX-100、1mol/L甜菜堿、內引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。

5、一種檢測單核增生李斯特菌的方法，其特征是使用權利要求1所述試劑盒，按下列步驟進行：

(1)將待測樣品于離心管中離心，去上清，沉淀中加入樣品預處理液并混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心后，上清即為待用的樣品模板DNA；

(2)在反應管中加入反應液38～40體積％、Bst?DNA聚合酶0.9～1.8體積％、穩定液52～54.5體積％、樣品模板DNA?4.5～9體積％，恒溫反應；

(3)在上述反應管和陽性對照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性。

6、根據權利要求5所述檢測方法，其特征在于步驟(2)中，恒溫反應的反應條件為溫度63～65℃，反應時間45～90min。

7、根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于所述穩定液為石蠟油。