[發明專利]一種篩選鎮痛中藥活性成分的細胞膜色譜法

無效

• 申請號: 200810027521.0
• 申請日: 2008-04-18
• 公開（公告）號: CN101285799A
• 公開（公告）日: 2008-10-15
• 發明（設計）人: 聶紅;尹震
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

技術領域

本發明屬于中藥活性成分篩選及作用機制研究領域，特別涉及一種篩選中藥鎮痛活性成分和確定其結合的阿片受體亞型的細胞膜色譜模型的建立方法。

背景技術

傳統的中藥活性成分篩選模式，如整體動物、系統、器官模型，存在著研究周期長、花費高、效率低的缺點；酶、受體模型無法反映中藥多組分、多靶點的特點。在眾多模型中，細胞膜色譜法脫穎而出，成為高效篩選中藥活性成分的新方法。

細胞膜色譜法(Cell?Membrane?Chromatography，CMC)是將人或動物的活性組織細胞膜固定在特定載體表面，制備成細胞膜固定相，通過紫外在線檢測被分析成分在細胞膜固定相上的保留特性，所得色譜參數與藥物和細胞膜及膜受體特異性結合密切相關，已成功用于多種中藥的活性成分篩選，克服了以往先從中藥中分離有效部位或單體，再分析其藥效，從而使成分分離與效應篩選脫節的弊端，是一種化學成分——效應——作用機制聯動的藥物研究方法。但此法同時也存在著不能滿足細胞膜所需要的溫度、壓力、離子強度及溶液pH等要求，且不能完全排除非特異性結合的問題。

現代研究表明阿片類藥物是通過作用于阿片受體而產生鎮痛作用的，體內阿片受體至少存在8種亞型，除中樞分布的阿片受體外，輸精管上也含有豐富的阿片受體，如小鼠輸精管主要含δ受體，也有部分μ和κ受體，家兔輸精管含單一的κ阿片受體，金倉鼠含有δ阿片受體，大鼠輸精管被認為含有ε受體。通過使藥物作用于不同種屬輸精管平滑肌細胞，考查其解離液在高效液相色譜柱上的行為，并用阿片受體激動劑和拮抗劑作參比，即可考查該藥物與某種阿片受體亞型的親和力。目前，已有人成功培養大鼠輸精管平滑肌細胞(Deferential?Smooth?Muscle?Cell，DSMC)，但小鼠DSMC和兔DSMC的體外培養未見報道。

發明內容

為了解決上述現有技術的不足之處，本發明的目的在于提供一種可同時篩選鎮痛中藥活性成分和確定其結合的阿片受體亞型的細胞膜色譜法。本發明將生物學部分與化學部分分開進行，有利于保持靶點的活性，能發揮特異性結合和色譜分析各自的長處。本發明所建立的輸精管細胞膜色譜法聯合應用了細胞萃取、高效液相色譜，對于多組分、多靶點的中藥活性物質的篩選有很高的適用性。

同時，本發明以富含不同阿片受體δ及κ亞型的小鼠、兔輸精管細胞膜為研究對象，用輸精管細胞膜色譜法特異性的研究中藥白芷和阿片受體的親和力，利用藥物效應的發揮是通過藥物與細胞靶點(受體)特異性結合的原理，證實了輸精管細胞膜色譜法確實可以反映白芷和阿片受體結合的特異性和選擇性。闡明了篩選出的白芷鎮痛活性成分對阿片受體有選擇性，且只特異性的結合阿片受體κ亞型，而與δ亞型無關。利用該模型研究制草烏獲得了相同的結果，因此該模型為其他鎮痛中藥的高選擇性快速篩選提供了新的方法，在中藥物質基礎和作用機制研究領域有廣闊的發展前景。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種可同時篩選鎮痛中藥活性成分和確定其結合的阿片受體亞型的細胞膜色譜法，包括如下步驟：

(1)白芷醇提液指紋圖譜的建立：稱取20g白芷藥材，加入160ml?95％乙醇，回流提取1～2h，揮干乙醇，殘渣用甲醇溶解定容至20ml，從中取250μl用甲醇稀釋至7.5ml，過0.45μm微孔濾膜，得到濾液即為白芷醇提液；吸取濾液20μl，采用高效液相色譜(HPLC)方法進行測定，得到白芷醇提液有效成分群指紋圖譜，確定其特征峰(具體見本申請人的在先專利申請，申請號為200610036947.3)，共13個共有指紋峰。

所述高效液相色譜分析條件：以甲醇-水為流動相系統，柱溫30℃，進樣量20μl，波長254nm，長度為250mm、直徑為4.6mm的Lichrospher5-C18色譜柱，流動相梯度：0～5min，5％～20％甲醇；5～15min，20％甲醇；15～20min，20％～70％甲醇；20～30min，70％甲醇；30～40min，70％～90％甲醇；上述均為體積百分比；

所述白芷醇提液指紋圖譜的13個共有指紋峰(特征峰)各相對保留時間分別為(以11號峰為參照)：

1號峰：0.031～0.034；2號峰：0.086～0.088；3號峰：0.607～0.649；

4號峰：0.658～0.665；5號峰：0.704～0.708；6號峰：0.730～0.739；

7號峰：0.749～0.755；8號峰：0.810～0.816；9號峰：0.842～0.847；

10號峰：0.856～0.861；11號峰：1；?????????12號峰：1.085～1.087；