[發明專利]定量熒光PCR快速檢測常見染色體三體的方法及試劑盒

無效

• 申請號: 200810027138.5
• 申請日: 2008-03-31
• 公開（公告）號: CN101550439A
• 公開（公告）日: 2009-10-07
• 發明（設計）人: 孫筱放
• 申請（專利權）人: 廣州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 劉宇峰

技術領域

本發明屬于醫學臨床檢測領域，涉及一種快速檢測常見染色體三體的方法，以及相應的試劑盒。

背景技術

流產和新生兒死亡最常見的原因是染色體異常，其中，第21、18、13號及性別染色體數目異常占出生后染色體異常總數的95％。唐氏綜合征為最常見，新生兒的發病率為1/800～1/600，我國每年大約有26600個先天愚型癡呆兒出生，平均每20分鐘就出生一例。由于目前尚無有效的治療方法，患者智力低下、常伴有多種嚴重的先天缺陷，給家庭和社會造成沉重的負擔。因此，及早檢測并防止患兒的出生，對降低其發病率無疑具有非常重要的意義。

傳統上采用羊水染色體檢測方法，該方法存在以下缺陷：①對于妊娠胎兒的檢查時間受到明顯的限制(僅能檢測妊娠16-22周的羊水染色體)；②對抽取樣本的數量要求較多；③耗時長(15-20天的培養時間)；④工作量大(需要人工顯微鏡下對染色體區帶進行分辨)；⑤不能保證母血污染羊水樣本結果的準確性。而作為羊水染色體檢查補充方法的臍帶血及絨毛染色體檢查的方法也同樣存在以上缺點。

近年來，對染色體異常進行檢測的分子遺傳學方法很多，包括：熒光原位雜交技術(FISH)、引物原位標記技術(PRINS)、同源基因定量PCR(HGQ-PCR)和實時定量PCR(Real-time?PCR)等。其中FISH和PRI?NS在設備和技術上有較高要求，限制了這些方法的普及和應用；同源基因定量PCR(HGQ-PCR)技術，僅能對唐氏綜合征進行檢測；實時定量PCR方法，通過對21號染色體和其他染色體Ct值比率或差值的比較分析，來檢測21號染色體的數目，但此方法對3個數量級以上的差別才能有較好的區分，而三體只是二體的1.5倍，區分度不大，另外Ct值的波動范圍較大，輕微的變化都有可能對結果有影響，容易造成誤診，其檢測的準確性還有待于進一步的研究和完善。

發明內容

本發明的目的在于提供一種準確、可靠的定量熒光PCR快速檢測常見染色體三體的方法。

本發明所述的一種定量熒光PCR快速檢測常見染色體三體的方法，包括以下步驟：

A.樣本的收集與處理：樣本為外周血或孕婦產前樣本，包括：孕16周以后采集的羊水，孕18周以后采集的臍帶血，或者孕13周前采集的絨毛，采用常規方法處理；

B.DNA提取：按常規苯酚-氯仿法提取前述樣本的DNA，用紫外分光光度儀測OD₂₈₀及OD₂₆₀值以確定濃度和純度，所需DNA純度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀的值為1.6～1.8；

C.引物設計和合成：

選擇分布在第21、18、13號染色體和性別染色體上的11個短串聯重復序列位點即STR位點，包括：21號染色體的三個STR位點：D21S11、D21S1411和D21S1412；18號染色體的四個STR位點：MBP、D18S535、D18S51和D18S386；13號染色體的三個STR位點：D13S631、D13S634和D13S317；X染色體的一個STR位點：XHPRT；另選擇性別染色體上特異性的AMXY位點；上述位點可在人類基因組數據庫即GDB網站中查詢獲得；

針對上述12個位點分別設計特異性引物，并在每對引物的反向鏈5’端加一段GTT?CTT序列；用不同的熒光素對已合成的引物進行標記；

D.第一體系和第二體系的PCR擴增反應：

進行兩個反應體系的PCR擴增反應，第一體系包括以下位點的引物：MBP、AMXY、D13S631和D13S634；第二體系包括以下位點的引物：D18S535、XHPRT、D21S11、D21S1411和D21S1412。

PCR擴增體系如下：

DNA模板???????????????2～40ng

引??物????????????????2～20pmol

熱啟動TaqDNA聚合酶????2U

10×PCR緩沖液?????????2.5μl

MgCl₂?????????????????1.5mmol/L

dNTP??????????????????200μmol/L

加水至總體積??????????25μl

PCR擴增條件為：95℃預變性11分鐘，94℃變性1分鐘，59℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進行30個循環，最后在60℃下延伸60分鐘；