[發明專利]食蟹猴的P450 2C9藥物代謝酶及其與食蟹猴P450氧化還原酶的共表達重組載體

無效

• 申請號: 200810027057.5
• 申請日: 2008-03-27
• 公開（公告）號: CN101250505A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: 戴仁科;溫鼎聲;王海濤;佘妙琴;白楊
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/53;C12N15/62;C12N15/866
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 劉孟斌

技術領域

本發明涉及基因工程研究領域，具體涉及一種食蟹猴(Cynomolgus?Monkey，Macacafascicularis)的P450?2C9藥物代謝酶(Cytochrome?P450?2C9)及其與P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome?P450?oxidoreductae)的共表達重組載體。

背景技術

細胞色素P450是重要的藥物代謝I相酶，市場上80％以上的藥物是通過細胞色素P450代謝的。2C亞家族是細胞色素P450基因家庭的主要成員，主要包括2C8、2C9及2C18幾個成員。細胞色素P450?2C9能夠代謝多種藥物如雙氯芬酸(Diclofenac)、甲苯磺丁脲(Tolbutamide)、華法林((s)-(-)-warfarin)等。目前，包括人，狗，大鼠，小鼠等多種動物的細胞色素P450基因序列已經被克隆，各種細胞色素P450也已經在大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞等宿主中表達。異源表達的細胞色素P450是研究藥物代謝，進行體外藥物篩選的重要手段。食蟹猴是常用的臨床前安全性評價實驗大動物，其與人的親緣關系非常接近，因而在代謝上表現出較高的相似性。到目前為止，仍未見食蟹猴與人P450?2C9亞型相應的基因的克隆的報道。因此，克隆食蟹猴P450?2C9基因并進行異源表達對于體外藥物篩選有重要意義。

P450酶在催化反應中需要兩個電子和兩個質子，其中的電子由內質網上的NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽，還原型輔酶II)-細胞色素P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome?P450oxidoreductae)提供。在體外反應中，缺少NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的系統不具有催化活性。到目前為止，將食蟹猴P450?2C9與食蟹猴P450氧化還原酶基因共表達還未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種食蟹猴的P450?2C9藥物代謝酶及其與食蟹猴P450氧化還原酶的共表達重組載體。克隆食蟹猴P450?2C9基因(cyp?2C9)并在昆蟲細胞中進行異源表達；還包括克隆食蟹猴NADPH-細胞色素P450氧化還原酶基因，構建包含NADPH-細胞色素P450氧化還原酶的食蟹猴P450?2C9(cyp?2C9)的昆蟲表達載體，并將此載體用于大量制備食蟹猴P450?2C9的代謝物。

本發明通過以下方式達到該目的：

本發明的食蟹猴(Cynomolgus?Monkey，Macaca?fascicularis)的P450?2C9藥物代謝酶(Cytochrome?P450?2C9)，能催化雙氯芬酸(Diclofenac)的4’-羥基化(4’-hydroxy)、甲苯磺丁脲(Tolbutamide)的4’-羥基化(4’-hydroxy)和華法林((s)-(-)-warfarin)的7’-羥基化(7’-hydroxy)。

根據已經發表的人P450基因序列(Genebank，Accession?NO.：NM_000771)，以逆轉錄自食蟹猴肝RNA的cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增食蟹猴P450?2C9的編碼區序列(cyp2C9)，擴增得到的PCR產物與pMD?18-T載體連接得到pT-cynoP2C9質粒。其中，設計的引物不包含除起始密碼(ATG)外的食蟹猴P450?2C9的編碼區序列(cyp?2C9)。經測序，得到的編碼區序列全長1473堿基對，編碼491個氨基酸。即P450?2C9藥物代謝酶的基因序列或其互補序列是與SEQID?NO：1的突變率為0-1％的序列。

本發明的食蟹猴的P450?2C9藥物代謝酶與P450氧化還原酶(NADPH-cytochrome?P450oxidoreductae)共表達的重組載體包含上述食蟹猴的P450?2C9藥物代謝酶序列的開放閱讀框和食蟹猴P450氧化還原酶序列的開放閱讀框。以上述克隆的食蟹猴P450?2C9的基因(cyp?2C9)為模板，以包含RsrII及HindIII限制性內切酶位點的引物擴增食蟹猴P450?2C9的編碼區序列(cyp?2C9)并定向插入昆蟲表達載體pFastBac-Dual的RsrII及HindIII酶切位點之間，得到pFB-cynoP2C9表達載體。按照Bac-to-Bac中表達食蟹猴P450?2C9蛋白。異源表達的食蟹猴P450?2C9蛋白可以用作體外篩選，測試藥物的代謝性質。