[發(fā)明專利]丙肝病毒特異性核酶M1GS－h(huán)cv/C20的構(gòu)建方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810026877.2
• 申請(qǐng)日: 2008-03-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101250510A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李紅枝;張文軍;陳偉強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東藥學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N9/22
• 分類號(hào): C12N9/22;C12N15/51;C12N15/55;C12N15/63;A61K38/46;A61P31/12
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳衛(wèi);任重

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種丙肝病毒特異性核酶M1GS-hcv/c20及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，基于核酶P(RNase?P)的反義技術(shù)在抗病毒研究領(lǐng)域受到廣泛重視，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者采用這類技術(shù)對(duì)包括人類巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、艾滋病毒、流感病毒等在內(nèi)的多種病毒進(jìn)行過(guò)研究，均發(fā)現(xiàn)其具有高效、特異性抑制病毒特定基因表達(dá)的作用，從而表明該技術(shù)在抗病毒領(lǐng)域的巨大潛力。核酶P是廣泛存在于各種生物細(xì)胞(包括真核細(xì)胞、原核細(xì)胞及古細(xì)菌)內(nèi)的一種天然大分子核酶，該核酶在細(xì)胞內(nèi)具有分布廣、含量豐富、活性高而穩(wěn)定等特點(diǎn)，其主要生物學(xué)功能是負(fù)責(zé)前體tRNA(ptRNA)5’前導(dǎo)序列的特異性切除，以促進(jìn)tRNA的成熟。對(duì)于任何序列已知的靶mRNA，理論上可設(shè)計(jì)一段相應(yīng)的引導(dǎo)序列(Guide?sequence，GS)與之結(jié)合并使之形成類似于ptRNA分子的結(jié)構(gòu)，從而被核酶P識(shí)別并切割。

與其他類型的核酶相比，RNase?P主要識(shí)別底物特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，即便靶基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列產(chǎn)生一定變異，但只要不引起其中某些特定二級(jí)結(jié)構(gòu)基序的變化，仍可被RNase?P識(shí)別并切割，這對(duì)于一些易變異病毒的抗病毒研究無(wú)疑具有重要意義。

丙型肝炎病毒(Hepatitis?C?virus，HCV)屬黃病毒科，基因組為正單鏈RNA，全長(zhǎng)約9600nt。是一種慢性化率極高的肝炎病毒，變異性極高，在其自然感染的過(guò)程中可持續(xù)突變，產(chǎn)生不同的型或亞型，以致于在同一HCV感染者體內(nèi)可同時(shí)存在具有多種序列組成不同但卻有很高同源性(同源性≥95％)的HCV變異株病毒群體，稱為HCV準(zhǔn)種(Quasispecies)。丙型肝炎病毒常引起肝硬化及肝癌，對(duì)人類健康造成重大危害。目前對(duì)該病毒尚未有特異有效的防治方法，常規(guī)的干擾素療法療效不甚理想且易反復(fù)，探索新的防治方法具有重要意義。

因此，采用RNase?P技術(shù)對(duì)HCV進(jìn)行抗病毒研究并構(gòu)建HCV特異性的人工核酶對(duì)于丙型肝炎病毒的抗病毒研究無(wú)疑具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種丙肝病毒特異性核酶M1GS-hcv/c20的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過(guò)所述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的丙肝病毒特異性核酶的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)予以實(shí)現(xiàn)：

提供一種丙肝病毒特異性核酶M1GS-hcv/c20的構(gòu)建方法，選取丙型肝炎病毒HCV基因組5’UTR中21～36nt之間的序列作為靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引導(dǎo)序列，將引導(dǎo)序列與大腸埃希菌核酶P共價(jià)相聯(lián)構(gòu)建得到。

所述引導(dǎo)序列為：5’-TTCATGGTGGAGTGTC-3’。

根據(jù)任何序列已知的靶mRNA，可設(shè)計(jì)一段相應(yīng)的引導(dǎo)序列(Guidesequence，GS)與之結(jié)合并使之形成類似于ptRNA分子的結(jié)構(gòu)，從而被核酶P識(shí)別并切割的理論，本發(fā)明在大腸埃希菌(E.coli)核酶P的基礎(chǔ)上，針對(duì)HCV基因組5’UTR設(shè)計(jì)一段GS序列，進(jìn)一步將兩者共價(jià)相聯(lián)，成功構(gòu)建了一種HCV特異性的人工核酶-M1GS-HCV/c20，并在此基礎(chǔ)上對(duì)該人工核酶的體外切割活性進(jìn)行了測(cè)定。

所述丙肝病毒特異性核酶M1GS-hcv/c20的構(gòu)建方法包括以下步驟：

步驟(1)設(shè)計(jì)引導(dǎo)序列；

依據(jù)GS的設(shè)計(jì)原則，選取HCV基因組5’UTR中21～36nt之間的序列作為靶位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)GS，該區(qū)序列為5’-GACACTCCACCATGAA-3’。該靶點(diǎn)稱為C20，針對(duì)C20靶點(diǎn)所設(shè)計(jì)的GS序列為：5’-TTCATGGTGGAGTGTC-3’。

本發(fā)明選擇背景相對(duì)比較清楚、來(lái)源于大腸埃希菌的RNase?P作為工具，針對(duì)HCV基因組序列較為保守區(qū)的5’UTR，成功將具有引導(dǎo)作用的GS序列與具有催化活性的RNase?P亞基-M1?RNA共價(jià)結(jié)合在一起，構(gòu)建了一種人工核酶-M1GS-HCV/c20。