[發(fā)明專利]一種簡(jiǎn)便高效分離純化植酸酶的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810026717.8
• 申請(qǐng)日: 2008-03-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101531999A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧開(kāi)健;何倩松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市開(kāi)恒生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/16
• 分類號(hào): C12N9/16
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)便高效分離純化植酸酶的方法。本發(fā)明尤其涉及一種從微生物深層發(fā)酵液中直接分離純化植酸酶。該方法具有分離純化簡(jiǎn)便、收得率高、純度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

背景技術(shù)

從微生物深層發(fā)酵液中分離純化酶的常用方法有：

(1)沉淀分離：通過(guò)改變某些條件，使溶液中某些溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，達(dá)到與其它溶質(zhì)分離的目的。沉淀分離的方法有很多種，諸如鹽析沉淀、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、復(fù)合沉淀、選擇性變性沉淀等。沉淀分離純化酶的收得率較高，一般在70％以上，但純度較低，一般在30-50％之間。

(2)層析分離：利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)(分子量大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)等)的不同，使各組分在兩相中的分布程度不同而達(dá)到分離。層析分離中一個(gè)是固定的，稱為固定相，另一個(gè)是流動(dòng)的稱為流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，各組分的移動(dòng)速度不同，從而使不同的組分分離純化。常用的有吸附層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析等。層析分離方法分離純化酶的收得率較低，一般在15-40％之間，純度在60％以上。

親和層析是利用生物分子對(duì)之間所具有的專一性而又可逆的親和力使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物、酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、酶與輔酶之間都是具有專一而可逆的親和力的分子對(duì)。在成對(duì)互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對(duì)樣品溶液(流動(dòng)相)中的另一方分子進(jìn)行親和層析。親和層析具有較強(qiáng)的選擇性，因此，分離純度高。但由于固相親和層析吸附劑的空間位阻作用，吸附容量低，制備親和層析柱價(jià)格高，成本高，所以，工業(yè)化大生產(chǎn)很難使用。該法分離純化酶的收得率一般在15-50％之間，純度在90％以上。

植酸酶和其催化的底物—植酸(或植酸鹽)是具有專一而可逆的親和力的分子對(duì)，可特異性地吸附。同時(shí)，植酸(或植酸鹽)具有極強(qiáng)的螯合能力，通常與鈣、鎂、鈉、鋅、鐵、銅、錳等礦物質(zhì)形成不溶性鹽類。本發(fā)明正是基于此而提出的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便高效分離純化植酸酶的方法。此法克服了通常分離純化方法中，在酶的純度提高的前提下，而收得率低的問(wèn)題。

在達(dá)到上述目的中，根據(jù)本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便高效的分離純化植酸酶的方法。先將產(chǎn)植酸酶的發(fā)酵液用離心機(jī)離心，收集上清液。利用植酸酶作用的底物——植酸(或植酸鹽)作為親和層析吸附劑，直接將植酸(或植酸鹽)加入到上清液中，充分?jǐn)噭颍菜?或植酸鹽)與植酸酶特異性吸附。由于植酸(或植酸鹽)具有極強(qiáng)的螯合能力，通常與鈣、鎂、鈉、鋅、鐵、銅、錳等礦物質(zhì)形成不溶性鹽類。此時(shí)，添加含有上述金屬離子的無(wú)機(jī)鹽可將植酸和植酸酶的結(jié)合體沉淀出來(lái)，采用上述離心機(jī)收集該沉淀，經(jīng)干燥機(jī)干燥即得植酸酶粉制劑。

根據(jù)本發(fā)明方法，所用植酸鹽主要是植酸鈉、植酸鈣等鹽，將植酸(或植酸鹽)先配成20％的水溶液，再取適當(dāng)?shù)牧考拥浇?jīng)過(guò)離心機(jī)離心的上清液中，使其濃度為0.2-0.8％，溫度10-35℃，pH5.0-7.5，在發(fā)酵罐或攪拌罐中，攪拌混合，此時(shí)，添加適量的金屬鹽溶液(用自來(lái)水稀釋)，使其濃度為0.03-0.1％，攪拌混合。兩次攪拌的轉(zhuǎn)速20-50轉(zhuǎn)/分，攪拌時(shí)間10-30分鐘。含有植酸(或植酸鹽)、金屬鹽的植酸酶混合物沉淀出來(lái)。采用離心機(jī)收集該沉淀，即為濕酶。經(jīng)真空耙式干燥機(jī)干燥即得植酸酶粉制劑。

具體實(shí)施方式

用去離子水將植酸(或植酸鈉、植酸鈣等)配成20％的水溶液，再取適當(dāng)?shù)牧考拥浇?jīng)過(guò)離心機(jī)離心的上清液中，使其濃度為0.2-0.8％，溫度10-35℃，pH5.0-7.5，在發(fā)酵罐或攪拌罐中，對(duì)其進(jìn)行混合攪拌。再加適量金屬鹽(用自來(lái)水稀釋)，使其濃度為0.03-0.1％，混合攪拌。兩次攪拌的轉(zhuǎn)速為20-50轉(zhuǎn)/分，攪拌時(shí)間10-30分鐘。

實(shí)施例1

取5公斤植酸，加去離子水至25公斤，混勻后，全部加到1000升經(jīng)離心后的上清液中，使其濃度為0.5％，25℃，pH5.0，攪拌混合。將3％MgSO₄10公斤加入到上述混合物中，使其濃度為0.03％，攪拌混合。混合物經(jīng)離心機(jī)離心，即得植酸酶濕酶粉劑。該濕酶粉經(jīng)真空耙式干燥機(jī)干燥即得植酸酶粉制劑。植酸酶純度達(dá)81.3％，收得率達(dá)76.6％。

實(shí)施例2