[發(fā)明專利]檢測沙丁胺醇?xì)埩舻拿嘎?lián)免疫試劑盒及其使用方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810025905.9
• 申請日: 2008-01-18
• 公開（公告）號: CN101241133A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 雷紅濤;楊金易;孫遠(yuǎn)明;沈玉棟;肖治理;王弘;袁利鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/535;G01N33/577
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明;任重

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測領(lǐng)域，具體的說，涉及一種檢測動物源性食品中沙丁胺醇?xì)埩舻拿嘎?lián)免疫檢測試劑盒及其方法。

背景技術(shù)

沙丁胺醇(salbutamol，Sal)，又名咳喘寧，屬于β2-腎上腺素能激動劑(BAA)的一種，臨床上廣泛用于治療支氣管哮喘。同時沙丁胺醇等β2-興奮劑還可作為牛、羊、禽、豬等畜禽的促生長劑，研究人員對其作用及效果也進行了深入廣泛的研究，并一度將其廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)。但由于β2-興奮劑易在動物臟器中積聚殘留，并可通過食物鏈進入人體，嚴(yán)重危害人類健康。隨著西班牙、荷蘭、法國、以及中國香港、廣東、上海等地相繼發(fā)生食用使用β2-興奮劑生產(chǎn)的肉制品的大規(guī)模中毒事件，歐盟、美國、中國等國家和地區(qū)都先后立法禁止在畜禽生產(chǎn)中使用促動物生長的β2-興奮劑作為飼料添加劑。克侖特羅(瘦肉精)由于其營養(yǎng)重分配作用的深入研究和廣泛應(yīng)用而引起有關(guān)方面的重視，國內(nèi)外均已研究出快速有效的檢測方法對其進行監(jiān)測，使得其非法使用受到了較有效的控制，而沙丁胺醇由于檢測手段研究的相對滯后，而又與克侖特羅具有同樣促生長效果，因而逐步取代克侖特羅，成為不法分子謀取經(jīng)濟利益的新手段。因此，建立快速、簡單、方便、有效的檢測手段是控制沙丁胺醇非法使用的迫切任務(wù)。

通常，檢測沙丁胺醇的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)，酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)等等。HPLC法與GC-MS法是沙丁胺醇?xì)埩魴z測的確證方法，其優(yōu)點是檢測精確度高，??但因其儀器化程度高、檢測時間長、復(fù)雜的樣品處理程序、檢測費用昂貴等，不適合用做大批樣品的檢測。在各種檢測方法中，適合應(yīng)用于大批檢測樣品的是EL?ISA檢測方法。它具有快速、靈敏、操作簡單和一次檢測樣品量大的特點，而且可以直接用尿液、血液樣品進行檢測，與HPLC、GC-MS有較高的相符率，而且非常適合活體動物的檢測。

目前國外已有商品化的沙丁胺醇ELISA檢測試劑盒，但是由于抗體特異性低，且采用間接競爭ELISA檢測模式等問題，現(xiàn)有產(chǎn)品普遍存在特異性低、穩(wěn)定性差、檢測步驟復(fù)雜等缺點。另外，檢索國內(nèi)相關(guān)專利仍未發(fā)現(xiàn)沙丁胺醇酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及方法的專利。

所以，目前現(xiàn)有沙丁胺醇采用的酶聯(lián)免疫檢測方法復(fù)雜、繁瑣，很難應(yīng)用于實踐，且現(xiàn)有產(chǎn)品由于普遍存在穩(wěn)定性差、檢測步驟復(fù)雜、設(shè)備條件要求較高、價格昂貴等不足，嚴(yán)重影響了沙丁胺醇?xì)埩魴z測與監(jiān)控，因此研發(fā)穩(wěn)定性高、操作簡單、設(shè)備要求低、廉價的沙丁胺醇ELISA試劑盒及其方法具有非常重要的經(jīng)濟和社會意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有沙丁胺醇檢測技術(shù)的不足，提供一種高特異性、高靈敏度、價格低廉、操作簡單，能大批量快速檢測沙丁胺醇的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。

本發(fā)明的另一目的是提供利用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測沙丁胺醇?xì)埩舻姆椒ā?/p>

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下測定原理：首先將沙丁胺醇抗原包被于固相載體例如酶標(biāo)板上，然后加入標(biāo)樣或待測樣品，再加入酶標(biāo)記沙丁胺醇抗體，包被抗原與待測樣品中的沙丁胺醇競爭酶標(biāo)抗體，待測樣品沙丁胺醇含量高時，則與固相抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體就少，反之結(jié)合在固相抗原上的酶標(biāo)抗體就多，反應(yīng)后加入底物進行顯色加以測定，當(dāng)酶標(biāo)抗體量一定時，加入的待測樣品含沙丁胺醇越多，與固相抗原結(jié)合酶標(biāo)抗體就越少，發(fā)色反應(yīng)減弱，百分吸光度值低，反之，則發(fā)色反應(yīng)增強，百分吸光度增高，因而根據(jù)百分吸光度值與沙丁胺醇濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)沙丁胺醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的百分吸光度值，即可推算出待測樣品中沙丁胺醇的濃度。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

提供一種檢測沙丁胺醇?xì)埩舻拿嘎?lián)免疫試劑盒，包括：

(1)包被沙丁胺醇抗原的酶標(biāo)板；

(2)酶標(biāo)記沙丁胺醇抗體工作液；

(3)沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液；

(4)底物液；

(5)底物緩沖液；

(6)反應(yīng)終止液；

(7)濃縮洗滌液；

(8)樣品稀釋濃縮液。

所述酶標(biāo)板是96孔或40孔酶標(biāo)板，酶標(biāo)板孔內(nèi)包被有能與抗沙丁胺醇抗體特異結(jié)合的沙丁胺醇抗原，其是使用碳二亞胺法(EDC)、活潑酯法(DCC、NHS)、混合酸酐法(氯甲酸異丁酯)，將沙丁胺醇半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的，所用的包被液為pH9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液，碳酸鹽緩沖溶液含1～2g碳酸鈉、2～4g碳酸氫鈉和雙蒸水1L，封閉液為1～5％脫脂奶粉溶液。