[發明專利]結核分枝桿菌檢測液相芯片及其制備方法

無效

• 申請號: 200810025686.4
• 申請日: 2008-01-08
• 公開（公告）號: CN101216491A
• 公開（公告）日: 2008-07-09
• 發明（設計）人: 許嘉森;林一群;楊惠夷
• 申請（專利權）人: 廣州益善生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/546;G01N33/533
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司
• 代理人: 萬志香;曾旻輝

1.一種結核分枝桿菌檢測液相芯片，其特征是，主要包括有：

1)包被微球：含有分別包被了ESAT-6捕獲抗體的微球、包被了CFP-10捕獲抗體的微球、包被了38kD蛋白捕獲抗體的微球、16kD蛋白捕獲抗體的微球，包被了LAM捕獲抗體的微球、包被了Ag85B捕獲抗體的微球，包被了MPT-64捕獲抗體的微球、包被TBGL捕獲抗體的微球中三種或三種以上，上述微球分別具有不同顏色編碼；

2)生物素標記檢測抗體：分別用生物素標記的ESAT-6、CFP-10、38kD蛋白、16kD蛋白、LAM、Ag85B、MPT-64及TBGL的檢測抗體中的對應于包被微球的三種或三種以上；和

3)鏈親和素藻紅蛋白。

2.一種制備權利要求1所述結核分枝桿菌檢測液相芯片的方法，主要包括以下步驟：

(1)相應的捕獲抗體包被微球：

-將50μL微球活化后，≥8000g，離心；

-吸棄上清，將微球重懸于pH5.0的230-280μL?50mM的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s，后將微球于≥8000g，離心1-2min；重復該步驟；

-吸棄上清，將微球重懸于100μL?50mM?pH5.0的MES的溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；

-往懸浮的微球中加入相應的0.8-1.2μg抗體，用50mM的pH5.0的MES溶液將總體積補至450-550μL；

-用渦漩振蕩器混勻，室溫避光振蕩1.5-2.5hr；

-偶聯了抗體后的微球以≥8000g的速度，離心1-2min；

-吸棄上清，將微球重懸于500μL?PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲振蕩約20s；

-室溫避光振蕩30min；再于≥8000g，離心1-2min；

-吸棄上清，將微球重懸于1mL?PBS-TBN溶液中，渦漩振蕩約20s，超聲約20s；微球≥8000g，離心1-2min；重復該步驟一次；

-吸棄上清，將微球重懸于500-1000μL?PBS-TBN溶液中；

-每種包被好的微球通過luminex儀器計數后置于2-8℃避光單獨保存，使用時，依據檢測需要等比例混合，使混合液中每種捕獲抗體偶聯微球的濃度均為40個/μl；

(2)每種檢測抗體的生物素標記：

-依據檢測抗體濃度計算出檢測抗體溶液稀釋至1mg/ml的體積，視為目標體積；

-配置10mg/ml的NHS-Biotin反應液；

-按摩爾比1∶100于反應管中分別加入檢測抗體與NHS-Biotin反應液；

-加入體積為目標體積的pH8.9的1/10的NaHCO₃溶液；

-加入pH7.4的PBS補至目標體積；

-包上鋁箔，將反應管置于振蕩器上，于25℃恒溫箱中避光孵育3-5小時，轉速為800rpm-1000rpm；

-將反應液轉至透析盒內，于PBS緩沖液中透析過夜，以去除未反應的NHS-Biotin；

-使用時根據需要將標記好的每種檢測抗體等比例混合，使每種檢測抗體最終濃度達到10ug/ml。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是：所述活化微球的步驟如下：

-用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球；

-取50μL微球離心1-2min；

-去掉上清夜，將微球重懸于100μL的雙蒸水中，用渦漩振蕩器或者超聲波懸浮微球約20s，≥8000g離心1-2min；

-吸棄上清，加入80μL的磷酸鹽緩沖液(pH6.2)，渦漩振蕩約20s，超聲波懸浮微球約20s；

-加入10μL?50mg/mL?Sulfo-NHS，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；

-加入10μL?50mg/mL?EDC，用渦漩振蕩器輕輕地混勻；

-室溫避光靜置20min，每10min用渦漩振蕩器輕輕地混勻。