[發(fā)明專利]一種產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810025335.3
• 申請(qǐng)日: 2008-04-25
• 公開（公告）號(hào): CN101264322A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 焦新安;董慧;潘志明;孫林;殷月蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K39/02
• 分類號(hào): A61K39/02;A61P31/04
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗及其制備方法。

技術(shù)背景

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria?monocytogenes，LM，又稱為單核細(xì)胞增生性李斯特菌)是一種胞內(nèi)生長、兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，是一種重要的食源性病原菌，能引起人畜共患李斯特菌病。LM對(duì)多種畜禽致病，并有較高的致死率，在人群中易感群體為孕婦、嬰兒、老年人和免疫受損者，主要引起腦膜炎、流產(chǎn)以及免疫缺陷病人和新生兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，發(fā)病率雖低，但死亡率高達(dá)30％～70％，因此對(duì)LM的研究具有重要的公共衛(wèi)生意義。鑒于此，人們正在研制安全有效的疫苗用于李斯特菌病的防控。

目前，廣泛使用的疫苗主要包括滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程疫苗等類型。減毒活疫苗應(yīng)用減毒或無毒力的活的微生物制成。動(dòng)物接種后，所獲得的免疫力持久而堅(jiān)強(qiáng)，但存在殘余毒力以及毒力上返祖的危險(xiǎn)。基因工程疫苗分為多種，其中基因缺失疫苗是在DNA或cDNA水平上缺失與病原體毒力有關(guān)的基因，但不明顯影響其復(fù)制能力，不破壞其作為疫苗株的免疫性，此種疫苗毒力弱，不會(huì)返祖，安全性好，但是總體上研制周期長，安全性尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。滅活疫苗研制方法簡單、快捷，目前開發(fā)出的大部分疫苗都屬于這種類型。傳統(tǒng)的滅活苗一般經(jīng)過甲醛滅活或熱滅活處理，機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答以體液免疫為主，引起的細(xì)胞免疫甚微。對(duì)于產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌等一類胞內(nèi)寄生菌，細(xì)胞免疫在清除以及產(chǎn)生長效免疫保護(hù)中的作用顯得更為重要。因此，尋求滅活疫苗新的制備技術(shù)有重要意義。

細(xì)菌經(jīng)過輻照作用完全失活，失去引起疾病的能力，同時(shí)輻照過的細(xì)菌保留了完整的結(jié)構(gòu)特征，能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)啟動(dòng)全面的防御。最重要的是輻照滅活細(xì)菌可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答，細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷寄生著LM的靶細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行徹底的清除。所以通過輻照方法生產(chǎn)滅活疫苗簡單安全、成本低、制作周期短，但至今還沒有相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是克服上述經(jīng)傳統(tǒng)方法制備的滅活疫苗的缺陷，提供能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的滅活疫苗的制備方法，即通過⁶⁰Co輻照制備產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

一種制備產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗的方法，其特征在于，將產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌經(jīng)⁶⁰Co輻照滅活制得滅活疫苗。

上述所說的輻照的條件，具體是：細(xì)菌樣品處于冰凍狀態(tài)以⁶⁰Co輻照源照射，輻照劑量不低于15KGy。輻照方式為靜態(tài)輻照，劑量率60Gy/min。

能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的細(xì)菌包括所有的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌，具體可以是產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌yzu?LM?1-2，或產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌LM-4。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供通過上述的⁶⁰Co輻照制得的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌滅活疫苗。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：通過輻照滅活的方法，保留了病原體表面的保護(hù)性抗原成分，能夠激發(fā)保護(hù)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。這些優(yōu)點(diǎn)在研制針對(duì)胞內(nèi)病原體的滅活疫苗時(shí)顯得尤為重要。

說明書附圖

圖1是輻照滅活LM的電鏡觀察結(jié)果圖

圖2是免疫攻毒后組織中細(xì)菌分離結(jié)果圖

圖3是T細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中攻毒后組織中細(xì)菌分離結(jié)果圖

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和效果實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

菌株：產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌yzu?LM?1-2，保藏號(hào)CCTCC?NO.M206107。

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌LM-4，由申請(qǐng)人分離并保存。

實(shí)施例1：輻照滅活細(xì)菌

細(xì)菌準(zhǔn)備：yzu?LM?1-2于BHI平板上劃線，37℃培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種液體BHI培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，離心收獲菌體，以磷酸鹽緩沖溶液洗滌、懸浮，調(diào)整細(xì)菌濃度至1×10¹⁰CFU/ml。