[發明專利]提高轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的方法

無效

• 申請號: 200810025299.0
• 申請日: 2008-04-30
• 公開（公告）號: CN101270366A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發明（設計）人: 貢成良;曹廣力;薛仁宇;周文林;沈衛德
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司
• 代理人: 陶海鋒

技術領域

本發明涉及一種轉基因表達系統，具體涉及一種提高轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的方法。

背景技術

目前應用的昆蟲桿狀病毒表達系統主要有兩個，一個以苜蓿尺蠖夜蛾核型多角體病毒為載體，以秋粘蟲細胞，菜青蟲細胞或昆蟲為宿主；另一為以家蠶核型多角體病毒為載體，以家蠶細胞或家蠶蟲體及蛹體為表達宿主。兩個表達系統都以各自病毒載體的多角體蛋白基因或P10基因或極早期基因IE-1等強啟動子為外源基因表達的調控元件，通過將外源目的基因置于強啟動子控制之下的重組病毒感染宿主細胞，有重組桿狀病毒在宿主和細胞體內進行大量復制，在病毒感染宿主的晚期，外源基因的轉錄產物大量積累，在較短時間內得到高效表達。

與上述昆蟲桿狀病毒表達載體系統相比，利用轉化細胞表達外源基因有其自身的優勢：

(1)翻譯后加工完善，天然活性高且穩定，可持續傳代，生產效率高；

(2)通過轉化細胞表達，整個過程中不涉及桿狀病毒，生物安全性相對提高，并且，外源基因整合進細胞基因組，不會出現因病毒感染而影響細胞功能的現象，因此，表達產物能夠得到更為有效的加工，如果借助無血清昆蟲細胞培養技術和分泌表達技術，表達產物將非常容易純化。

通常情況下，通過抗生素壓力篩選可以獲得穩定表達外源基因的轉化細胞。運用G418篩選哺乳動物轉化細胞已有較多的報道，但通過穩定轉化的昆蟲細胞表達外源基因的報道并不多見。Jarvis等用攜帶neo標記基因和ie-1(苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的極早期基因)啟動子控制β-半乳糖苷酶基因表達盒的質粒轉染sf-9細胞，通過G418壓力篩選，獲得轉化sf-9細胞純系，傳代50次(約6個月)后的細胞仍保留整合的質粒序列，傳代100次的細胞仍能表達同質的β-半乳糖苷酶，但表達水平較低，約為桿狀病毒表達載體系統(BEVS)的1％(J?Cell?Biochem，1990，42：181-191)。

最近，Invitrogen公司開發了一種能在昆蟲sf細胞穩定表達外源基因的載體pIZT/V5-His，該載體利用黃杉毒蛾(Orgyia?pseudotsugata)核型多角體病毒的ie-2啟動子控制外源基因，通過Zeocin的抗性標記篩選可獲得穩定表達外源基因的細胞系。

鑒于利用轉基因昆蟲細胞表達外源基因具有的優越性，因此，獨立研發提高穩定轉化昆蟲細胞表達外源基因的水平的方法具有重要意義。

發明內容

本發明目的是提供一種提高轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的方法。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案是：一種提高轉基因昆蟲細胞表達外源基因水平的方法，包括以下具體步驟：

(1)構建昆蟲細胞內具有活性的啟動子X控制外源基因的載體；

(2)構建帶有增強子元件en的基于piggyBAC轉座子的帶有報告基因的載體pigA3-en；

(3)雙酶切步驟(1)所得載體，回收啟動子X控制外源基因的片段，克隆進同樣雙酶切的pigA3-en，得帶有增強子en和啟動子X控制外源基因的載體；

(4)構建昆蟲細胞內具有活性的啟動子Y控制新霉素抗性基因neo的重組載體；

(5)酶切步驟(4)所得載體，回收啟動子Y控制新霉素抗性基因的片段Y-Neo，克隆進同樣酶切的步驟(3)所得載體，得到帶有啟動子X控制外源基因表達盒、增強子元件、啟動子Y控制新霉素抗性基因和熒光蛋白報告基因的重組轉基因載體；

(6)將步驟(5)所得重組轉基因載體與表達轉座酶的輔助質粒混合，轉染昆蟲細胞系，通過G418的分段篩選獲得轉基因昆蟲細胞，其中G418的終濃度為800-2000μg/ml。

上述技術方案中，昆蟲細胞內具有活性的啟動子X和Y選自桿狀病毒的極早期基因(ie-1)啟動子、家蠶肌動蛋白(actin)A3啟動子、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)的CMV啟動子、昆蟲熱激蛋白(hsp)啟動子中的一種，啟動子X和啟動子Y可以相同也可以不同；所述的增強子元件en選自家蠶絲素蛋白輕鏈基因第1內含子序列——fiben、桿狀病毒的同源區——hr3en中的一種；報告基因可以為熒光蛋白基因；昆蟲細胞可以是家蠶細胞或者其他昆蟲組織建立的細胞系。

上述技術方案中所述輔助質粒的選擇為該技術領域中常規的技術，該領域技術人員可以根據最后獲得的具體轉基因載體選擇相應的輔助質粒。