[發明專利]一種草莖點霉的遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 200810024634.5
• 申請日: 2008-03-28
• 公開（公告）號: CN101544986A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發明（設計）人: 譚仁祥;豐明乾;周添;魏聞捷;韓越
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 黃嘉棟

技術領域

本發明涉及草莖點霉(Phoma?herbarum)的電穿孔遺傳轉化技術，適用于草莖點霉的遺傳工程以及草莖點霉分子生物學研究等領域。

背景技術

草莖點霉不僅是某些動植物的病原菌，而且也是一種可用于雜草防治的生防菌。由草莖點霉引起的動植物病害有植物黑脛病和鮭鱒魚類的鰾真菌病(吳慶禹等，東北林業大學學報，2005，33(2)：43-45；Mohamed?Faisal?et?al，2007，Mycopathologia(2007)163：41-48)。目前已從草莖點霉中分離出了至少三種不同類型的活性化合物(Jose′Fausto?Rivero-Cruz?et?al，J.Nat.Prod.2003，66，511-514；Vikrant?et?al，J.of?Phytopathol.154(7-8)：461-468；Xiao?Bing?Yang?et?al，Biochimie?87：747-754)。近年來，我們從草莖點霉中分離到了一種抗腫瘤的多糖YCP，生物活性和臨床前的研究均表現出良好的結果。在國家863、國家自然科學基金等國家級科研項目基金的大力支持下，YCP多糖的研究已經非常接近成藥了。在相關的基礎研究方面，我們不僅建立了草莖點霉成熟的工業發酵工藝，而且對YCP多糖的生物合成途徑也展開了深入的研究。因此，草莖點霉非常有望成為具有良好開發前景的絲狀真菌之一。可以預見，今后很多研究將試圖通過基因工程的辦法改良菌種。同時，草莖點霉對植物和魚類致病的分子生物學機制研究也將引起高度重視，但是，遺傳轉化方法的研究是對草莖點霉實施基因工程和分子生物學研究的前提。

絲狀真菌的遺傳轉化目前主要有醋酸鋰介導的孢子轉化法、PEG介導的原生質體轉化法、農桿菌介導的轉化法和電穿孔轉化法。在草莖點霉中，目前還沒有建立任何轉化方法。我們嘗試過前3種轉化方法，均不理想。電穿孔轉化技術在微生物等的遺傳轉化中具有較高的效率，而且簡單易行，在原核生物中已有廣泛的應用。Bio?Rad、Phamacia等世界著名公司已開發了電穿孔儀。

本發明首次利用了電穿孔技術對草莖點霉實施了外源基因轉化，找到了合適的轉化條件，并優化了裂解酶的組合，轉化方法簡單，轉化效率高，此法可用于草莖點霉的遺傳工程以及分子生物學研究和應用。

發明內容

本發明目的是提供一種利用電穿孔技術對草莖點霉進行外源基因的遺傳轉化方法，并找到轉化效率較高的轉化參數組合，可用于草莖點霉基因工程以及分子生物學研究等領域。

本發明達到發明目的所采用的技術方案是：利用真菌細胞壁降解酶對草莖點霉的細胞壁進行處理，得到原生質體并進行純化，純化的原生質體和適量外源基因(DNA)水溶液進行混合，然后利用電穿孔儀對混合液進行電擊處理，電擊處理的原生質體可以吸納外源DNA，從而實現了外源DNA對草莖點霉的遺傳轉化。

本發明的技術方案如下：

一種草莖點霉的遺傳轉化方法，它由下列步驟組成：

(1)將草莖點霉原生質體用緩沖液EB懸浮，以顯微鏡檢查計數，調整原生質體液的原生質體濃度至10⁷-10⁸/ml，所述的緩沖液EB為一種水溶液，其中含：濃度為2mM的2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪]乙磺酸(HEPES)，pH7.5，濃度為0.6M的甘露醇(mannitol)，濃度為1mM的MgCl₂，在121℃高壓滅菌20min，

(2)將用于轉化的外源DNA溶于無菌去離子水至終濃度為1μ1g/μl，每100μl原生質體液中加入5μg?DNA，混勻，冰浴冷卻20min，成混合液，所述的外源DNA為任何可以轉化真菌的DNA或質粒，

(3)在預冷的電擊杯中加入步驟(2)所得混合液，冰浴冷卻5min后用電穿孔儀進行電擊，