[發明專利]一種蠟狀芽孢桿菌CPU0029菌株及用它制備石斛類生物堿的方法

有效

• 申請號: 200810024502.2
• 申請日: 2008-03-25
• 公開（公告）號: CN101265459A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發明（設計）人: 呂煒鋒;王紅蘭;姚文兵;廖晨陽
• 申請（專利權）人: 呂煒鋒;王紅蘭
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/10;C12R1/085
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及微生物領域，具體是涉及一種石斛內生細菌(蠟狀芽孢桿菌CPU0029菌株)，以及用該菌生產石斛類生物堿的方法。

技術背景

植物內生菌(Plant?endophyte)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的微生物，而被感染的宿主植物(至少是暫時)并不表現出外在病癥。既包括互惠共利的和中性的內共生微生物，也包括那些潛伏在宿主體內的病原微生物，這些微生物有細菌、真菌、放線菌等。

近些年來，植物內生菌由于能夠產生豐富多樣的具有多種生物活性的次生代謝產物，在自然界中具有重要的生態學作用，受到了全世界的廣泛關注并取得了極大進展。植物內生菌能夠產生植物生長調節類物質，殺蟲抗菌物質，抗腫瘤類物質，及其他類型的代謝產物，如一些內生真菌能產生細胞壁分解酶，用以克服宿主防御異物的天然屏障，還能產生果膠酶、纖維素酶、酯酶等胞外酶。由于內生菌和宿主植物的共生(或寄生)，其次生代謝產物往往有特殊的生物活性。人們發現有的內生菌能夠產生與宿主(尤其是藥用植物)相同或類似的化合物，如從南方紅豆杉樹皮中分離到的能夠產生紫杉醇的內生真菌，從長春花、桃兒七等植株中分離到產長春新堿和鬼臼毒素類似物的內生真菌，從華重樓中分離到能夠產生重樓甾體皂甙的內生細菌，在德國鳶尾根狀莖中分離得到產鳶尾酮的絲狀真菌等。這就為植物藥物的生產提供了新的途徑，并且對珍貴稀有藥用植物的保護和開發有著積極作用。

石斛(Dendrobium?nobile?Lindl)是中國傳統中藥，應用歷史悠久。現代藥理研究表明，石斛具有抗腫瘤、抗衰老、增強機體免疫力、擴張血管及抗血小板凝集等作用，因此在臨床上及中藥復方中被廣泛應用。由于多年來的掠奪性采挖和無序開發，野生石斛已經瀕臨滅絕，尋找新的、可再生的石斛替代資源成為必然。

發明內容

本發明的目的是提供一株從新鮮石斛外植體中篩選分離得到內生菌，該菌能產生與石斛相同的有生物活性的次生代謝產物，本發明還提供了用該菌生產石斛生物堿的方法。

所說的石斛內生細菌，是蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?cereus)CPU0029，保藏單位：中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC?NO：M208020。

所說的用蠟狀芽孢桿菌CCTCC?M208020生產石斛類生物堿的方法，包括以下步驟是：

(1)發酵培養：以PDA培養基為種子培養基，改良PDA培養基為發酵培養基對蠟狀芽孢桿菌CPU0029?CCTCC?M208020進行發酵；

(2)分離純化：將發酵液上清堿化后過濾，經氯仿或乙酸乙酯萃取，回收有機溶劑得到浸膏。

為了減少萃取時有機溶劑的用量，還可以在萃取前將濾液經過大孔樹脂富集后，將洗脫液濃縮后再堿化。

得到的浸膏產物還可再經硅膠柱層析進一步純化。

蠟狀芽孢桿菌CPU0029?CCTCC?M208020能夠利用多種有機碳源，如葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉等，但不能利用枸櫞酸鹽；該菌也能夠利用多種有機氮源，如蛋白胨、酵母粉、玉米漿、牛肉膏等(除尿素外)，也可以利用含有機氮源和無機氮源的復合氮源，但不能利用單一的無機氮源，如硫酸銨、亞硝酸鈉、硝酸銨等。該菌的培養溫度范圍寬，在10-40℃均能生長，但在25-37℃生長較好，生產次生代謝產物的最佳溫度為28-30℃。同時各種金屬離子，如Mg²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、K⁺、Na⁺等對該菌生長沒有顯著影響。雖然上述碳源、氮源、金屬離子以及溫度對該菌的生?長沒有明顯影響，但是其碳氮源濃度、金屬離子和培養溫度對該菌發酵生產次生代謝產物有顯著影響。通過優化，確定最佳培養條件為去皮土豆20％，葡萄糖2％，蛋白胨0.25％，硫酸銨0.25％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，氯化錳0.01％，起始pH6.5，培養溫度28-30℃。