[發明專利]豬圓環病毒2型滅活疫苗

無效

• 申請號: 200810024423.1
• 申請日: 2008-03-21
• 公開（公告）號: CN101240264A
• 公開（公告）日: 2008-08-13
• 發明（設計）人: 姜平;王先煒;李玉峰
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司
• 代理人: 張素卿

一.技術領域

本發明豬圓環病毒2型滅活疫苗屬于生物技術高科技領域，專用于加強豬對PCV2免疫保護作用及減少豬場的經濟損失。

二、技術背景

PCV-2是世界范圍內的一種豬病，給世界的養豬業造成了巨大的損失。該病毒主要引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥和腎病皮炎綜合癥。同時該病在一定程度上還會造成免疫抑制，容易造成其它疾病的繼發或并發感染，尤其是該病與PRRS有相互協同作用。由于該病毒是一種DNA病毒，病毒的變異率低，同時在世界范圍內的致病只有PCV2一型。同時該病毒自身有很好的抗原性，能夠誘導機體產生高水平的抗體和對該病提供保護作用。但是該病毒分離困難、鑒定困難、培養困難，因此在我國目前還沒有一個有效的防治該病的疫苗上市。有鑒于此，我實驗室投入了大量的人力、物力對該病毒進行分離、鑒定等工作。并對獲得的分離株SH株經大規模培養后制備了滅活疫苗進行免疫實驗，證明效果良好。

三、發明內容

技術問題??本發明的目的是研制一種能夠有效控制豬圓環病毒病的疫苗，使我國當前發生的PCV2病得到有效的控制，從而可以減少豬場的損失和提高經濟效益。

技術方案??本發明的實施方案如下：

豬圓環病毒2型(PCV2)，其特征在于，豬圓環病毒2型屬于圓環病毒科圓環病毒屬。這科病毒有雞貧血病毒、鸚鵡喙羽病病毒。豬圓環病毒2型是動物病毒中最小的一員。病毒粒子的直徑14～25nm，二十面體對稱，無囊膜，基因組為單股DNA。豬圓環病毒2型(SH)已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏號為CGMCC?No.2389。

上述豬圓環病毒2型(PCV2)SH毒株，是通過以下獲得的：

(1)病毒的分離和培養2002年從上海地區發生嚴重的斷奶仔豬多系統衰竭綜合癥的豬場采集病料，病料經勻漿、反復凍融3次后，高速離心后經0.22um濾膜過濾后接種于長滿單層的PK-15細胞。對接種病料的PK-15細胞進行連續傳代進行病毒分離。

(2)豬圓環病毒2型陽性分離株的鑒定將PK-15細胞連續傳代6代后，取其中的部分細胞經凍融后提取PCV-2病毒的DNA，用針對PCV-2病毒Cap蛋白基因的特異性PCR引物對目的基因擴增。擴增產物克隆入pMD-18T載體進行測序。

(3)PCV2-SH分離株的純化鑒定好PCV2分離株經有限稀釋法進行病毒純化，工進行3次病毒純化，獲得了純化的PCV2病毒的上海分離株(SH)。

上述豬圓環病毒2型(PCV2)SH毒株制備疫苗的方法為：

將PCV2-SH株在PK-15細胞中大量增殖，經甲醛滅活加入白油佐劑進行乳化，制備常規的白油佐劑疫苗。在擴大病毒培養過程中取用低溫保存的PCV2(SH)按10⁴TCID₅₀接種長成單層的PK-15細胞。接種24小時后，棄去維持液，用D-氨基葡萄糖進行孵育，然后棄去D-氨基葡萄糖加入維持液，3天后收毒。

用上述豬圓環病毒2型SH毒株制成的疫苗：

將純化的PCV2病毒在PK-15細胞上連續傳代50次，每5代通過IPMA法測定病毒的效價。證明該病毒在PK-15細胞中連續傳代表現穩定，接毒后細胞病變出現規律，種毒的毒價穩定在10^4.33TCID₅₀/1.0ml。

有益效果

本發明首次提出了用PCV2分離毒株制備針對PCV2的滅活疫苗，該疫苗的研究和制備解決了我國當前對該病無法進行預防的缺陷，可以有效的解決當前PCV2發病率高，造成損失大的影響。用分離株制備的滅活疫苗工藝簡單、操作方便，而且制備出的疫苗抗原性好，安全性高，對外界環境無任何不良影響，容易通過安全評價。

試驗證明，本發明制備的PCV2-SH株滅活疫苗對動物不產生任何不良反應，試驗安全性高，而且對免疫動物能夠誘導產生高水平的循環抗體和中和抗體，ELISA抗體效價達到，中和抗體效價達到，免疫后的動物能夠有效的抵抗PCV2病毒的攻擊。

針對我國目前PCV2發病率比較高，該疫苗的制備、生產、應用和普及將為防止我國的PCV2疾病的發生和流行提供有力的工具。

四、附圖說明

圖1.病毒增殖曲線

五、具體實施方式：

1、毒種來源及標準

制造本品用和檢驗的毒種為PCV2-SH毒株，由南京農業大學農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室在2002年從上海某豬場分離鑒定而來，命名為ShangHai分離株(簡稱SH株)。

1.1毒種標準