[發明專利]一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子及其編碼基因與應用

無效

• 申請號: 200810024036.8
• 申請日: 2008-04-25
• 公開（公告）號: CN101270156A
• 公開（公告）日: 2008-09-24
• 發明（設計）人: 許琳;嚴明;劉紅梅;郝寧;來燦鋼;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C07K14/39
• 分類號: C07K14/39;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/19;C12P7/06;C12R1/865
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所
• 代理人: 柏尚春

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種突變的釀酒酵母起始轉錄因子spt15-10及其編碼基因與應用。

背景技術

木質纖維素是世界上最為豐富的生物質資源，量最大、價最廉，每年的總產量約占所有生物質資源的50％，目前大多數此類的物質沒有得到很好的利用。利用木質纖維素為主的可再生生物質資源，生產可再生能源具有重要的經濟與社會意義。以生物質為原料制取的工業乙醇，作為一種清潔的可再生能源，是替代石油等化石燃料的必然趨勢。傳統的生物乙醇生產主要以糧食發酵為主，世界糧食緊缺現象嚴重限制了原料來源，原料成本居高不下，低成本的新原料路線是降低生物乙醇生產成本的關鍵。在傳統的生物乙醇生產中，以葡萄糖為主的六碳糖易于被微生物發酵生成乙醇，然而占總糖量約40％的木糖卻不易于被其利用。充分利用木質纖維素生產乙醇原料中的木糖發酵生產乙醇，能使乙醇的產量在原有基礎上增加25％。木糖的有效利用是提高乙醇經濟指標的重要內容，是生物質資源成功工業化轉化的關鍵因素。

釀酒酵母(S.cerevisiae)是真核微生物，細胞壁厚、固醇含量高，對乙醇及木質纖維素水解物中毒性因子的耐受性較高；能在低pH、嚴格厭氧條件下快速發酵葡萄糖生產乙醇，副產物少；不易被細菌和病毒污染，且相關工業技術成熟，一直是乙醇發酵的研究重點和首選目標微生物。但缺乏有效利用木糖的能力。以木質纖維素為原料生產乙醇，其關鍵之一就是產生乙醇的微生物能有效利用各種糖作為碳源。在國外，早在上世紀八十年代初期，國際上許多實驗室就已經開始從事其高效生產乙醇的研究。但是天然的釀酒酵母菌只能非常緩慢的代謝木糖，卻不能有效發酵木糖。由于天然微生物的木糖發酵性能難以達到工業生產的要求，所以人們利用傳統的菌種篩選方法通常經過大量的微生物培養、酶活測定及菌種馴化培養來選育所需菌種，由于工作量大、耗時長、效率低，近年來已轉向利用代謝工程原理，通過分子遺傳改造相關代謝途徑來獲得能在厭氧條件下高效代謝發酵葡萄糖、木糖及其他各種戊糖的工程菌。但以前的研究大部分沒有得到十分理想的目標表型。我們認為這些單基因或幾個基因的改造，某種的基因缺失或者擴增，只是改變了細胞的局部元件，或是重新設計調節了細胞網絡代謝產物的平衡系統，并沒有解決木糖代謝途徑中的復雜問題。

基因表達調控是也成為生物學目前應用手段熱點。全局轉錄機制調控工程(globetranscriptional?mechanism?engineering，gTME)是用分子生物學方法，如易錯PCR、DNA改組等方法，建立通用轉錄因子的突變庫，針對目的產品或目標表型，通過定向篩選，獲得目的代謝流增強或特定表型增強的菌種，是按人們的設計獲得目標表型的一種方法。

釀酒酵母具有木糖代謝的完整途徑，但是卻不能有效的發酵木糖產乙醇。我們解決這些問題模擬微生物適應外界環境的改變，在酵母菌木糖代謝途徑的基因組層面上定向進化或同時改變多個相關基因群，使細胞在整體水平上適應木糖的代謝或利用，我們利用gTME技術通過基因工程方法改造全局轉錄調控因子使整個轉錄調控過程發生變化從而改變或提高基因組的轉錄及表達。從而獲得了能夠高效利用木糖并能夠同時轉運木糖和葡萄糖產乙醇的釀酒酵母。

全局轉錄調控工程(gTME)是一種基因轉錄重排來優化細胞表型的主要技術。正是通過基因工程方法改造全局轉錄調控因子SPT15，利用易錯PCR技術構建該因子突變庫，實現多基因的同時改變來調節整個的代謝網絡?，F在應用于提高釀酒酵母的乙醇耐受性和產量?；虮磉_過程是從DNA→mRNA→蛋白質?；虮磉_調控可以發生在遺傳信息傳遞過程的各個水平上。已證明轉錄水平調控是基因表達調控中效率最高的一個環節。轉錄是由RNA聚合酶執行的，在原核細胞中只有一種RNA聚合酶，在真核生物有三種RNA聚合酶，其中RNA聚合酶II負責轉錄產生大部分功能基因(圖1)的mRNA，RNA聚合酶II轉錄效率是由轉錄起始因子和啟動子結合能力決定的(圖2)。釀酒酵母中轉錄起始因子之一的SPT15，是一種TATA結合蛋白，參與轉錄起始復合物的形成，控制基因表達效率。它與相關基因啟動子區域TATA結合能力的改變，影響相關基因表達效率，將引起菌種的表型變化，所以用分子生物學方法建立SPT15基因突變菌種庫，在突變庫中含有眾多菌種表型，通過定向篩選SPT15基因突變菌種庫，可獲得具有目標表型的釀酒酵母菌種。本課題組在2007年成功地建立了該項技術，構建釀酒酵母轉錄因子spt15突變庫，經篩選，獲得了共發酵戊糖和己糖的釀酒酵母菌，得到了重組菌中spt15的突變序列。為進一步改造菌種有效利用纖維素水解液發酵高產乙醇研究奠定了基礎。