[發(fā)明專利]一種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810024036.8
• 申請(qǐng)日: 2008-04-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101270156A
• 公開(kāi)（公告）日: 2008-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許琳;嚴(yán)明;劉紅梅;郝寧;來(lái)燦鋼;歐陽(yáng)平凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/39
• 分類號(hào): C07K14/39;C12N15/31;C12N15/63;C12N1/19;C12P7/06;C12R1/865
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 柏尚春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種突變的釀酒酵母起始轉(zhuǎn)錄因子spt15-10及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素是世界上最為豐富的生物質(zhì)資源，量最大、價(jià)最廉，每年的總產(chǎn)量約占所有生物質(zhì)資源的50％，目前大多數(shù)此類的物質(zhì)沒(méi)有得到很好的利用。利用木質(zhì)纖維素為主的可再生生物質(zhì)資源，生產(chǎn)可再生能源具有重要的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)意義。以生物質(zhì)為原料制取的工業(yè)乙醇，作為一種清潔的可再生能源，是替代石油等化石燃料的必然趨勢(shì)。傳統(tǒng)的生物乙醇生產(chǎn)主要以糧食發(fā)酵為主，世界糧食緊缺現(xiàn)象嚴(yán)重限制了原料來(lái)源，原料成本居高不下，低成本的新原料路線是降低生物乙醇生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。在傳統(tǒng)的生物乙醇生產(chǎn)中，以葡萄糖為主的六碳糖易于被微生物發(fā)酵生成乙醇，然而占總糖量約40％的木糖卻不易于被其利用。充分利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇原料中的木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，能使乙醇的產(chǎn)量在原有基礎(chǔ)上增加25％。木糖的有效利用是提高乙醇經(jīng)濟(jì)指標(biāo)的重要內(nèi)容，是生物質(zhì)資源成功工業(yè)化轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。

釀酒酵母(S.cerevisiae)是真核微生物，細(xì)胞壁厚、固醇含量高，對(duì)乙醇及木質(zhì)纖維素水解物中毒性因子的耐受性較高；能在低pH、嚴(yán)格厭氧條件下快速發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙醇，副產(chǎn)物少；不易被細(xì)菌和病毒污染，且相關(guān)工業(yè)技術(shù)成熟，一直是乙醇發(fā)酵的研究重點(diǎn)和首選目標(biāo)微生物。但缺乏有效利用木糖的能力。以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇，其關(guān)鍵之一就是產(chǎn)生乙醇的微生物能有效利用各種糖作為碳源。在國(guó)外，早在上世紀(jì)八十年代初期，國(guó)際上許多實(shí)驗(yàn)室就已經(jīng)開(kāi)始從事其高效生產(chǎn)乙醇的研究。但是天然的釀酒酵母菌只能非常緩慢的代謝木糖，卻不能有效發(fā)酵木糖。由于天然微生物的木糖發(fā)酵性能難以達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，所以人們利用傳統(tǒng)的菌種篩選方法通常經(jīng)過(guò)大量的微生物培養(yǎng)、酶活測(cè)定及菌種馴化培養(yǎng)來(lái)選育所需菌種，由于工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，近年來(lái)已轉(zhuǎn)向利用代謝工程原理，通過(guò)分子遺傳改造相關(guān)代謝途徑來(lái)獲得能在厭氧條件下高效代謝發(fā)酵葡萄糖、木糖及其他各種戊糖的工程菌。但以前的研究大部分沒(méi)有得到十分理想的目標(biāo)表型。我們認(rèn)為這些單基因或幾個(gè)基因的改造，某種的基因缺失或者擴(kuò)增，只是改變了細(xì)胞的局部元件，或是重新設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)了細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)代謝產(chǎn)物的平衡系統(tǒng)，并沒(méi)有解決木糖代謝途徑中的復(fù)雜問(wèn)題。

基因表達(dá)調(diào)控是也成為生物學(xué)目前應(yīng)用手段熱點(diǎn)。全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)控工程(globetranscriptional?mechanism?engineering，gTME)是用分子生物學(xué)方法，如易錯(cuò)PCR、DNA改組等方法，建立通用轉(zhuǎn)錄因子的突變庫(kù)，針對(duì)目的產(chǎn)品或目標(biāo)表型，通過(guò)定向篩選，獲得目的代謝流增強(qiáng)或特定表型增強(qiáng)的菌種，是按人們的設(shè)計(jì)獲得目標(biāo)表型的一種方法。

釀酒酵母具有木糖代謝的完整途徑，但是卻不能有效的發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇。我們解決這些問(wèn)題模擬微生物適應(yīng)外界環(huán)境的改變，在酵母菌木糖代謝途徑的基因組層面上定向進(jìn)化或同時(shí)改變多個(gè)相關(guān)基因群，使細(xì)胞在整體水平上適應(yīng)木糖的代謝或利用，我們利用gTME技術(shù)通過(guò)基因工程方法改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子使整個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程發(fā)生變化從而改變或提高基因組的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。從而獲得了能夠高效利用木糖并能夠同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)木糖和葡萄糖產(chǎn)乙醇的釀酒酵母。

全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程(gTME)是一種基因轉(zhuǎn)錄重排來(lái)優(yōu)化細(xì)胞表型的主要技術(shù)。正是通過(guò)基因工程方法改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SPT15，利用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建該因子突變庫(kù)，實(shí)現(xiàn)多基因的同時(shí)改變來(lái)調(diào)節(jié)整個(gè)的代謝網(wǎng)絡(luò)。現(xiàn)在應(yīng)用于提高釀酒酵母的乙醇耐受性和產(chǎn)量。基因表達(dá)過(guò)程是從DNA→mRNA→蛋白質(zhì)。基因表達(dá)調(diào)控可以發(fā)生在遺傳信息傳遞過(guò)程的各個(gè)水平上。已證明轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中效率最高的一個(gè)環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)錄是由RNA聚合酶執(zhí)行的，在原核細(xì)胞中只有一種RNA聚合酶，在真核生物有三種RNA聚合酶，其中RNA聚合酶II負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大部分功能基因(圖1)的mRNA，RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄效率是由轉(zhuǎn)錄起始因子和啟動(dòng)子結(jié)合能力決定的(圖2)。釀酒酵母中轉(zhuǎn)錄起始因子之一的SPT15，是一種TATA結(jié)合蛋白，參與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，控制基因表達(dá)效率。它與相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域TATA結(jié)合能力的改變，影響相關(guān)基因表達(dá)效率，將引起菌種的表型變化，所以用分子生物學(xué)方法建立SPT15基因突變菌種庫(kù)，在突變庫(kù)中含有眾多菌種表型，通過(guò)定向篩選SPT15基因突變菌種庫(kù)，可獲得具有目標(biāo)表型的釀酒酵母菌種。本課題組在2007年成功地建立了該項(xiàng)技術(shù)，構(gòu)建釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子spt15突變庫(kù)，經(jīng)篩選，獲得了共發(fā)酵戊糖和己糖的釀酒酵母菌，得到了重組菌中spt15的突變序列。為進(jìn)一步改造菌種有效利用纖維素水解液發(fā)酵高產(chǎn)乙醇研究奠定了基礎(chǔ)。