[發(fā)明專利]一種含CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的篩選及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810023903.6
• 申請日: 2008-04-18
• 公開（公告）號: CN101265453A
• 公開（公告）日: 2008-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周長林;羅眾球;閆蓬勃;邱蔚然
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學;南通秋之友生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N11/04;C12Q1/04;C12P19/30;C12R1/865
• 代理公司: 南京蘇科專利代理有限責任公司
• 代理人: 姚姣陽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的篩選以及該啤酒酵母菌在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

胞苷三磷酸(簡稱：CTP)是機體細胞內(nèi)的一種正常成分，它在體內(nèi)參與核酸和磷脂類的合成代謝，促進蛋白質(zhì)的合成，并提供能量，還可以調(diào)節(jié)和促進神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血管壁細胞膜性結(jié)構(gòu)的合成與構(gòu)建，能夠?qū)褂膳d奮性氨基酸、自由基引起的神經(jīng)細胞損傷，從而起到抗血管硬化的作用。而胞苷一磷酸激酶(CMP?kinase)和胞苷二磷酸激酶(CDP?kinase)的主要作用是負責激活胞苷三磷酸合成酶(CTP?synthetase)，激活胞苷三磷酸合成酶能降低胞苷一磷酸(簡稱：CMP)水平，使CMP合成CTP。目前已有廠家生產(chǎn)CTP注射液制劑，臨床上主要用于治療多種原因引起的神經(jīng)系統(tǒng)及心血管類疾病，如腦血管意外及其后遺癥；腦震蕩、外傷性昏迷、顱腦手術(shù)后功能障礙；神經(jīng)官能癥；腦血管硬化、老年性癡呆；外周神經(jīng)損傷；兒童腦發(fā)育不全等。(Ishige?Kazuya，2002)枯草芽孢桿菌jofC編碼CMP激酶，啤酒酵母中URA6編碼CMP激酶(Shinya?Kaneko，1998)。大腸桿菌中mssA基因編碼CMP激酶已被Fricke等人證實，雖然CMP激酶不是大腸桿菌所必需，但CMP激酶在ATP提供磷?；闆r下，可逆催化CMP轉(zhuǎn)化CDP，進而生成CTP：

ATP·Mg²⁺+CMP→ADP·Mg²⁺+CDP

ATP·Mg²⁺+CDP→ADP·Mg²⁺+CTP

CTP的合成工藝方法主要包括化學法、生物合成法、光合磷酸法等。由于底物價格的原因，國內(nèi)外對CTP工業(yè)化生產(chǎn)的研究甚少，在我國真正生產(chǎn)CTP的企業(yè)基本上沒有，但自發(fā)現(xiàn)可作為藥物以后，市場需求逐年增大，隨著CMP價格的逐年下降，生產(chǎn)前景十分看好。CTP在上世紀80年代國內(nèi)的生產(chǎn)方法主要都是通過分離出酵母體內(nèi)的自身酶系對CM?P進行轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)工藝比較成熟，但該工藝不能完全分離出糖酵解系統(tǒng)中的所有酶，酶失活率高，轉(zhuǎn)化率低，(Ethan?SSimon，1990)。應國清等人(2004)利用游離的啤酒酵母將CMP合成為CTP，CTP的轉(zhuǎn)化率可維持在80％左右，詹谷字等人(1997)用菠菜葉綠體通過光合磷酸化反應將CMP合成為CTP，轉(zhuǎn)化率為85％。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是公開一種含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌。

本發(fā)明的另一個目的是提供篩選該啤酒酵母菌的方法。

本發(fā)明的再一個目的是公開該啤酒酵母菌在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應用。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達到以上目的：一種含有CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌(Saccharomyces?cerevisiae)菌株，菌落為乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊，其在2008年4月10日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號是：CGMCC?NO.2448。

所述菌株的篩選方法的步驟包括：

(1)制作酵母菌懸液，將酵母經(jīng)培養(yǎng)基活化后放入搖床振蕩培養(yǎng)到細胞處于對數(shù)生長期后離心回收菌體，加入磷酸鹽緩沖液制成菌懸液；

(2)將上述菌懸液與誘變劑按1∶1容量比混合，30℃恒溫水浴10-50分鐘后，混合液稀釋至10^-3倍-10^-6后涂布平板，得到抗性菌株；

(3)將上述抗性菌株經(jīng)搖床培養(yǎng)24-36小時，用高效液相色譜法檢測并篩選出含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌株；其中，搖床的溫度為26-36℃，轉(zhuǎn)速為160-300rpm，所述步驟(2)中的誘變劑是2mg/ml的亞硝基胍；所述平板中的培養(yǎng)基含有300μg/ml胞苷三磷酸結(jié)構(gòu)類似物胞苷二磷酸-乙醇胺，所述抗性菌株為胞苷二磷酸-乙醇胺抗性突變株。

本發(fā)明的啤酒酵母菌菌株在生產(chǎn)胞苷三磷酸中的應用包括：利用包埋法以卡拉膠-魔芋多糖復配膠為載體將所述菌種制成固定化細胞后加入合成胞苷三磷酸的反應體系中，再利用離子交換分離純化的方法分離純化反應液，最后結(jié)晶得到胞苷三磷酸。其具體步驟是：

(1)將卡拉膠鈉鹽和魔芋粉溶于去離子水中，蒸汽加熱到121℃后保溫40～70分鐘，倒入反應釜中自然冷卻到40℃，膠液保溫，其中k-卡拉膠鈉鹽與魔芋粉的重量比為2∶1；

(2)將生理鹽水加入洗滌好的啤酒酵母濕菌體中攪拌均勻制成酵母懸液，35℃保溫，其中生理鹽水和啤酒酵母濕菌體的重量比為1∶4；