[發明專利]用載肝細胞生長因子聚乳酸－O－羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養方法

無效

• 申請號: 200810023474.2
• 申請日: 2008-04-07
• 公開（公告）號: CN101250498A
• 公開（公告）日: 2008-08-27
• 發明（設計）人: 陳鐘;常仁安;李志峰
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 南通市永通專利事務所
• 代理人: 葛雷

技術領域：

本發明涉及一種肝細胞的培養方法。

背景技術：

急性肝衰竭死亡率高達70％。肝細胞移植可以起到一定的肝功能支持和促進肝再生作用。由于其具有操作簡單、對機體生理環境干擾小、供體來源廣泛等優點，已引起了眾多研究者的廣泛關注。然而，如何提高移植肝細胞的活性、降低免疫排斥反應和促進受體肝再生是急需解決的三大問題。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種可有效促進肝細胞生長、提高肝細胞活力的用載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養方法。

本發明的技術解決方案是：

一種用載肝細胞生長因子(HGF)聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的肝細胞培養方法，其特征是：在肝細胞培養時，將載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子與肝細胞混合進行接種培養。

所述載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子是通過下列步驟制得：將載肝細胞生長因子加入到聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子懸浮溶液中，在4℃、800rpm電磁攪拌的條件下充分反應4小時，然后10000rpm高速離心、蒸餾水洗滌、冷凍抽干，得到固化的載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子。

肝細胞培養時，培養溫度為35～38℃，且5％CO₂條件下培養，培養12小時內，每30分鐘振蕩一次，每次持續5分鐘。

肝細胞與載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的用量關系為：5×10⁵個/ml肝細胞與40μg/ml的載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子相混合接種。

本發明可有效促進肝細胞生長，提高肝細胞活力，必定對肝細胞培養技術的發展起到巨大的推動作用。實驗證明，與普通肝細胞培養相比較，本發明培養的肝細胞形成球形聚集體的時間明顯縮短，球形聚集體的比例明顯增加，細胞形態好，培養后第2天至第7天，采用CCK-8體外細胞增殖試劑盒檢測培養肝細胞的活力，發現載HGF納米培養組生成黃色甲臢染料的量高于普通培養組(P＜0.05)。表明載HGF納米培養組活細胞數目多于普通培養組，載HGF納米粒子在體外能夠持續地促進大鼠肝細胞生長和活性的保持。

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。

圖1是載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子透射電鏡照片。

圖2是載肝細胞生長因子聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子掃描電鏡照片。

下面結合實施例對本發明作進一步說明。

具體實施方式：

聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖(PLA-O-CMC)納米粒子的制備：

將10ml濃度為0.03％的PLA(聚乳酸)二氯甲烷溶液與10ml濃度為0.15％的O-CMC溶液在超聲情況下充分反應(約25分鐘左右)，待其中的有機溶劑揮發完全后得到乳光較重的均勻懸濁液。將此懸濁液先以2000rpm低速離心5分鐘，取低速離心后所得的上清液以14000rpm高速離心10分鐘，得到部分白色沉淀，吸去部分上清液，將沉淀用蒸餾水離心洗滌兩次后，將沉淀冷凍抽干取出并行鈷-60輻照消毒后備用。

載HGF的聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的制備：

稱取5mg?PLA-O-CMC納米粒子放入5ml去離子水中進行超聲波分散，制得納米粒子懸浮溶液。取5μg?HGF加入5ml?PLA-O-CMC納米粒子懸浮溶液中，在4℃、800rpm電磁攪拌的條件下充分反應4小時，然后10000rpm離心、蒸餾水洗滌、冷凍抽干，得到固化的載HGF的聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子。

載HGF聚乳酸-O-羧甲基殼聚糖納米粒子的表征：

透射電子顯微鏡觀察：取5mg固化的載HGF的PLA-O-CMC納米粒子放入5ml去離子水中進行超聲波分散，制得納米粒子懸浮溶液。然后將少量懸浮溶液滴到已載膜的銅網上，用濾紙吸去多余的液體，晾干后即制成樣品，透射電子顯微鏡觀察載HGF的PLA-O-CMC納米粒子的結構、粒徑及表面形貌。

激光粒度儀/zeta電位儀測試：用激光粒度儀/zeta電位儀檢測上述載HGF的PLA-O-CMC納米粒子懸浮溶液中載HGF納米粒子的粒徑和表面電位。